溪荪花部建立病毒诱导基因沉默体系的方法技术

本发明专利技术公开了一种鸢尾属植物溪荪花部上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，涉及鸢尾属植物花色、花型改良的基因工程领域，最佳接种部位是未着色花苞时期，侵染液需先用现配，在侵染液的配制中提高了携带病毒载体的农杆菌的菌体浓度至OD

【技术实现步骤摘要】
溪荪花部建立病毒诱导基因沉默体系的方法


[0001]本专利技术涉及溪荪花部性状改良的基因工程领域，具体地说是一种在溪荪植株花部建立病毒诱导基因沉默体系的方法。

技术介绍

[0002]溪荪(Iris sanguinea)为鸢尾科鸢尾属多年生草本植物。由于其极强的抗寒能力和较高的观赏价值一直被认为是东北地区亟待开发的一种重要园林绿化和切花植物，已在多地作为观赏植物广泛应用。虽然我们在溪荪花色育种中取得一系列成果，但由于溪荪等单子叶植物遗传转化体系建立非常困难，花色基因功能验证只能通过烟草、矮牵牛等异源植物来实现，这使得其花色调控机理研究进展较慢，特殊花色育种一直很难有所突破。
[0003]病毒诱导的基因沉默(Virus
‑
induced gene silencing，VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可引起内源mRNA序列特异性降解。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus)介导的VIGS因其寄主范围广、构建方便、效果明显，已成为目前应用范围最广的病毒载体，VIGS已作为一种高效的反向遗传学新技术应用于很多植物花色基因功能研究，包括蝴蝶兰、矮牵牛、月季和番茄等，非常适合缺乏稳定遗传转化体系的物种进行基因功能分析，并已经在多个植物的生长发育过程的关键基因功能研究中成功使用。当前，还未曾报道过以多年生的大田鸢尾为实验对象建立病毒诱导基因沉默体系的研究，利用VIGS技术建立溪荪基因功能研究的技术体系，可能是通过溪荪本体植物解析基因分子调控机理的有效手段。
专利技术内容
[0004]为解决上述存在的技术问题，本专利技术提供了一种以大田条件下溪荪植株为实验对象建立其花部病毒诱导基因沉默体系的方法，本方法简单高效，且易于在室外进行操作。
[0005]本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：(1)确定接种时期：大田溪荪处于花苞未着色时期，接种时间为晴朗无风的下午3点以后；(2)配制侵染液：侵染液现用现配，配制方法如下：首先，挑取带有相应病毒质粒的农杆菌阳性克隆于1ml YEB液体培养基中，该培养基中含有卡那霉素50μg/mL、利福平20μg/mL，28℃条件下，在带橡胶塞的玻璃试管中200r/min震荡6
‑
8h至浑独而不泛白；其次，将摇至浑浊的菌液分别再用50mL YEB液体培养基培养，该培养基中含有卡娜霉素50μg/mL、利福平20μg/mL，200r/min条件下震荡，在菌液浓度达OD
600
到1.8
‑
2.0时取出；然后，离心收集菌体，均用25mL侵染缓冲液悬浮菌体，该侵染缓冲液以无菌水作为溶剂，其中含有MES 10mM、AS 200μM、MgCl
2 10mM，调节农杆菌液浓度菌液浓度达OD
600
到1.8
‑
2.0，制成农杆菌侵染缓冲液，缓冲液OD
600
为0.8
‑
1.0为最佳；
最后，将含有等浓度pTRV1的农杆菌侵染缓冲液分别与含有pTRV2和pTRV2
‑
目的基因片段的农杆菌浸染缓冲液等体积混合，黑暗条件下室温静置，形成两种农杆菌侵染液；(3)接种部位的选择：选择溪荪未着色时期的花苞为接种部位；(4)病毒载体的接种：采取1mL注射器，先自花苞顶部扎入一个伤口，再用针头将1mL侵染液注射到溪荪的花苞中，保证花苞直立，菌液不会留出，接种后无需避光，挂牌注明处理组别及处理时间；(5)基因沉默效率检验：组别包括病毒空载体组、病毒与目的基因复合载体组和未经处理的空白对照组，首先对上述三组样本进行表型观测，其次对所有组别经处理过的相应组织部位的植物材料提取RNA，合成第一链cDNA，进行PCR检测并通过琼脂糖凝胶电泳进行条带观测，以确定TRV病毒和目的基因的存在，最后通过计算PCR检测的有效数量与处理总数之间的比值来确定此次的基因沉默效率。
[0006]步骤(2)侵染液配置过程中，农杆菌用50mL YEB液体培养基置于250mL锥形瓶中，200r/min条件下震荡，当菌液体积小于摇菌容器1/5时，摇菌及侵染效果最佳。
[0007]步骤(3)中选择的时期为溪荪的花苞时期，此时溪荪花苞并未着色。长度为2.5
‑
3cm，花苞完整且花亭直立，能够承载菌液。如注射过的花苞出现倒伏现象，可用支撑装置保持花亭与花苞的直立状态，让侵染液与花苞保持充分接触的状态。
[0008]步骤(4)病毒接种时操作应注意侵染液保持1mL的量，并且用带有针头的无菌注射器自上而下对花苞进行扎伤，保证花苞有伤口，可以与侵染液充分接触。
[0009]步骤(4)病毒接种时，应在同一植株中进行等量的空载和目的基因处理。
[0010]步骤(5)中所有组别样本的表型观测具体操作为自接种第一日起，在根据沉默目的基因的功能所预测的性状改变发生的日期前后，对基因沉默处理的区域的相关性状进行不同组别之间的观测对比，并统计好相应的数量。
[0011]由于大田条件下环境影响因素较多，且溪荪本身具有较强的抗性，低浓度的菌液并不会达到相应的侵染效果，所以提高农杆菌的浓度至OD
600
到1.8
‑
2.0，使携带病毒载体的农杆菌数量足够，且将重悬液浓度调整为OD
600
到0.8
‑
1.0，既提高了菌液载体的数量又保证了的侵染的成功率，侵染实验完成后注意观察植株状态，无需套袋遮光，如遇到阴雨天气，可进行适当遮盖。
附图说明
[0012]附图1病毒诱导基因沉默操作示意图；
[0013]附图2通过VIGS技术获得的IsANS基因沉默溪荪中PCR检测重组质粒片段的电泳图；
[0014]附图3溪荪通过VIGS技术获得的IsANS基因沉默溪荪花瓣表型图；
[0015]附图4空白对照、空载对照和IsANS基因沉默溪荪花瓣中IsANS基因表达量变化检测结果图。
具体实施方式
[0016]下面结合具体实施例及附图来进一步详细完整地阐述本专利技术，而非限制本专利技术。大田鸢尾属植株上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，以花青素合成酶
(Anthocyanin synthase,ANS)为报告基因，基于TRV构建溪荪花部VIGS体系，通过如下步骤实现：
[0017]确定接种时期：5月中旬至6月中旬期间，接种时间为下午3点以后。
[0018]用基因工程的方法将扩增后的溪荪花青素苷合成酶(IsANS)基因特异性片段连接到TRV病毒诱导基因沉默载体p TRV2中，得到p TRV
‑
IsANS；
[0019]具体步骤如下：
[0020]按康为世纪RNA提取试剂盒操作说明提取溪荪花瓣的总RNA，以1μg的总RNA做模板，按照TaKaRa cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA的第一链，然后稀释10倍备用；
[0021]IsANS基因的扩增：上游引物5
’‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸢尾属植物溪荪植株花部上建立病毒诱导基因沉默体系的方法，侵染部位为溪荪未着色的花苞时期，长度为2.5
‑
3cm，花苞完整且花葶直立。2.将目的基因连接pTRV2病毒载体，并与pTRV1质粒分别导入农杆菌中，再将两种农杆菌按体积比1∶1混合后用于侵染。3.如权利要求2所述的方法，侵染液现用现配，以无菌水作为溶剂，其中含有MES 10mM、AS 200μM、MgCl
2 10mM，调节农杆菌菌液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玲，刘桂伶，叶王斌，王磊，吕汝彤，闫蕾，史恭发，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：