一种农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法技术

本申请提供了一种农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法，包括：将目标芍药幼苗完全浸没在预设转化液中，进行负压强度为10的处理，得到目标芍药组培苗和实生苗；在28℃黑暗条件下将所述目标芍药组培苗振荡侵染24h，芍药实生苗振荡侵染12h，得到侵染后的目标芍药组培苗和侵染后的芍药实生苗；将侵染后的目标芍药组培苗和侵染后的芍药实生苗分别接入固体共培养基和细沙中，在25℃黑暗条件下培养3天，得到培养后的目标芍药组培苗和实生苗；对培养后的目标芍药组培苗和实生苗进行GUS染色，完成目的基因的瞬时过量表达。不依赖于昂贵的实验器材，成本低；转化过程简单快捷，全程仅需4

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法


[0001]本申请涉及植物遗传转化
，尤其是涉及一种农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法。

技术介绍

[0002]芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是芍药科芍药属的多年生宿根草本花卉，是中国的传统名花，因其既具有药用价值，又是能提供极佳观赏价值的经济植物而被广泛引种，是重要的园林应用花卉，深受人们喜爱。
[0003]随着种植面积的不断增加，芍药将要面临的环境挑战也会更加复杂，因此，研究芍药抗逆相关基因的功能具有重要意义。目前，常用的基因功能研究是将目的基因在本植物进行稳定遗传，得到转基因植株。对于芍药而言，虽然目前国内外有关芍药属植物组织培养方面的研究有了很大进步，但仍然存在外植体易污染、褐化及玻璃化，愈伤组织再分化困难，难以诱导出健壮的丛生苗，以及芍药无菌苗生根困难等问题，尚未建立成熟的遗传转化体系，因此，目前国内外研究芍药的基因功能多利用模式植物，如烟草、拟南芥等。
[0004]植物的瞬时表达可在较短的时间内实现目的基因短暂的高水平表达，与稳定转化相比，它不依赖于异源DNA的染色体整合，操作更加简单、快速且成本低，使得该技术成为研究无再生体系的植物基因功能的有力工具。瞬时转化的常见方法有粒子轰击转化法、PEG介导原生质体转化法、植物病毒载体介导转化法和农杆菌介导转化法，与其他转化方法相比，农杆菌介导转化法可提供很高的转化效率，因为胞间空间占植物组织体积的三分之一，农杆菌通过渗透的方式被积极地运送到胞间空间，这为农杆菌进入大多数植物细胞提供了有效途径，从而使T
‑
DNA有效转移，并且该过程无需仪器设备，同时允许处理大量的植物，还可以在一片叶子上用几个转基因构建物进行多个瞬时表达分析。目前，该技术已成功应用于许多植物，如拟南芥、桦树、柳树、杨树、陆地棉、月季、棉花等。但在芍药中建立瞬时表达系统的研究还未见报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本申请的目的在于提供一种农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法，在一定程度上解决芍药在基因功能研究上存在的问题，提供了一种可在芍药幼苗中快速、高效地实现目的基因瞬时表达的方法，用于芍药抗逆相关基因的功能验证研究。
[0006]本申请实施例提供了一种农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法，包括：
[0007]将目标芍药幼苗完全浸没在预设转化液中，进行负压强度为10的处理，得到目标芍药组培苗和实生苗，其中，所述目标芍药幼苗为芍药粉玉奴(
♀
)和粉玉楼(
♂
)杂交种子的种胚在启动培养基中萌发30天的芍药组培苗和经沙藏长出2
‑
3cm芽的实生苗，所述预设转化液为将经过二次活化OD
600
值达到1.2的农杆菌菌液离心并重悬于含有AS和表面活性剂的转化液；
[0008]在28℃黑暗条件下将所述目标芍药组培苗振荡侵染24h，芍药实生苗振荡侵染
12h，得到侵染后的目标芍药组培苗和侵染后的芍药实生苗；
[0009]将侵染后的目标芍药组培苗和侵染后的芍药实生苗分别接入固体共培养基和细沙中，在25℃黑暗条件下培养3天，得到培养后的目标芍药组培苗和实生苗；
[0010]对培养后的目标芍药组培苗和实生苗进行GUS染色，完成目的基因的瞬时过量表达。
[0011]可选的，所述OD
600
值为1.2的农杆菌菌液是在100mL含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体培养基中进行二次活化得到的，其中，LB液体培养基由酵母浸粉、胰蛋白胨和NaCl组成，其中，每升中加入酵母浸粉5g、胰蛋白胨10g和NaCl 10g，pH为7.0；植物表达载体是含有GUS报告基因的pCAMBIA1301；农杆菌菌株是EHA105；菌液培养条件为28℃200rpm暗培养；菌液OD
600
值利用分光光度计进行测定；转化液由MS、MES、MgCl2、AS、Tween
‑
20和蔗糖组成，其中每100mL中加入MS 0.214g、MES 1mM、MgCl
2 2mM、AS 200μM、Tween
‑
20 0.01％和蔗糖3g，pH为5.8。
[0012]可选的，所述固体共培养基由MS、GA3、6
‑
BA、AS、蔗糖和琼脂组成，其中每升中加入MS 2.14g、蔗糖30g、AS 200μM、GA
3 0.5mg、6
‑
BA1.0mg和琼脂6.5g，pH为5.8。
[0013]可选的，所述对培养后的目标芍药组培苗和实生苗进行GUS染色，完成目的基因的瞬时过量表达的步骤，包括：
[0014]将培养后的目标芍药组培苗和实生苗浸没在GUS染色液中，进行GUS组织化学染色，完成目的基因的瞬时过量表达。
[0015]为使本申请的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0017]图1是芍药组培苗GUS染色照片；
[0018]图2是芍药实生苗GUS染色照片；
[0019]图3是萌发时间对芍药组培苗瞬时转化效率的影响；
[0020]图4是菌液浓度对芍药组培苗瞬时转化效率的影响；
[0021]图5是侵染时间对芍药组培苗瞬时转化效率的影响；
[0022]图6是AS浓度对芍药组培苗瞬时转化效率的影响；
[0023]图7是共培养时间对芍药组培苗瞬时转化效率的影响；
[0024]图8是负压强度对芍药组培苗瞬时转化效率的影响；
[0025]图9是Tween
‑
20浓度对芍药组培苗瞬时转化效率的影响；
[0026]图10是侵染时间对芍药实生苗瞬时转化效率的影响；
[0027]图11是非生物胁迫下瞬时过表达芍药幼苗中抗逆基因的表达水平。
具体实施方式
[0028]为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的每个其他实施例，都属于本申请保护的范围。
[0029]首先，对本申请可适用的应用场景进行介绍。本申请可应用于芍药抗逆相关基因的功能验证研究。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法，其特征在于，包括：将目标芍药幼苗完全浸没在预设转化液中，进行负压强度为10的处理，得到目标芍药组培苗和实生苗，其中，所述目标芍药幼苗为芍药粉玉奴(
♀
)和粉玉楼(
♂
)杂交种子的种胚在启动培养基中萌发30天的芍药组培苗和经沙藏长出2
‑
3cm芽的实生苗，所述预设转化液为将经过二次活化OD
600
值达到1.2的农杆菌菌液离心并重悬于含有乙酰丁香酮和表面活性剂的转化液；在28℃黑暗条件下将所述目标芍药组培苗振荡侵染24h，芍药实生苗振荡侵染12h，得到侵染后的目标芍药组培苗和侵染后的芍药实生苗；将侵染后的目标芍药组培苗和侵染后的芍药实生苗分别接入固体共培养基和细沙中，在25℃黑暗条件下培养3天，得到培养后的目标芍药组培苗和实生苗；对培养后的目标芍药组培苗和实生苗进行GUS染色，完成目的基因的瞬时过量表达。2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的芍药瞬时表达的方法，其特征在于，所述OD
600
值为1.2的农杆菌菌液是在100mL含有50mg/LKan和50mg/LRif的LB液体培养基中进行二次活化得到的，其中，LB液体培养基由酵母浸粉、胰蛋白胨和NaCl组成，其中，每...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓梅，葛佳媛，裴新辉，费日雯，赵晴雯，霍丽茹，康雪宁，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：