水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用制造技术

本发明专利技术涉及水稻抗性育种，具体涉及水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用。本发明专利技术的技术方案是水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用，所述水稻DT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在抗旱育种过程种，通过将上述水稻抗旱调控蛋白DT1的表达的物质导入水稻，可以显著提高水稻的抗旱性。水稻抗旱调控蛋白DT1的作用使得其发现和相关突变体的鉴定以及对水稻抗旱分子育种具有重要的应用价值。对水稻抗旱分子育种具有重要的应用价值。对水稻抗旱分子育种具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用


[0001]本专利技术涉及水稻抗性育种，具体涉及水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用。

技术介绍

[0002]水稻生产需要消耗大量的淡水资源，但我国天然降水呈现总量少、分布不均匀等特点，导致部分地区季节性干旱频发，严重制约着我国水稻生产。通过遗传改良增强水稻抗旱性是节约淡水资源、提高水稻产量的有效途径之一。
[0003]水稻抗旱性是一个由多基因控制的数量性状，遗传基础较为复杂。目前，已鉴定超过650个的水稻干旱胁迫相关数量性状基因位点。通过正向与反向遗传学手段鉴定出很多的水稻抗旱调控因子，如DRO1、OsbZIP23、OsTPS1。DRO1编码一个生长素响应蛋白，受到生长素负向调控，调控水稻根系的不对称生长和对重力响应的向下弯曲，从而改变水稻避旱能力。过表达OsbZIP23的转基因水稻对ABA的敏感性和干旱胁迫的耐受性显著提高，调控OsPP2C49和9
‑
顺式
‑
环氧类胡萝卜素双加氧酶基因OsNCED4的表达。过表达OsTPS1提高了水稻幼苗对干旱处理的耐受性。然而，水稻抗旱调控的机理极其复杂，亟待挖掘新的抗旱调控基因。
[0004]生长素响应因子(auxin response factor,ARF)是一类特异性地结合到生长素响应元件(AuxREs)上的转录因子，参与调控生长素响应。在水稻基因组中有25个ARF基因。OsARF4与OsARF6负调控水稻籽粒大小，其突变体均表现为籽粒变大与千粒重增加；OsARF16参与磷酸盐饥饿应答；OsARF12突变导致水稻对多种真菌菌株表现出过敏反应。然而，在水稻抗旱性调控中，至今未见有相关报道。因此，鉴定参与水稻抗旱性调控的ARF基因，有助于揭示和完善水稻抗旱调控网络，为培育节水抗旱型水稻新品种提供基因资源。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是为培育抗旱性水稻品种提供一种新选择。
[0006]本专利技术的技术方案是水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用，所述水稻DT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]进一步的，所述水稻DT1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]具体的，所述应用为下调水稻DT1蛋白的表达在提高水稻抗旱能力中的应用。
[0009]其中，所述下调水稻DT1蛋白的表达的方法是：构建针对DT1蛋白的sgRNA表达载体，进而转化根癌农杆菌，导入水稻细胞中。
[0010]优选的，所述sgRNA表达载体的靶序列为SEQ ID NO.1第471～490位和/或第572～591位所示的核苷酸序列。
[0011]本专利技术的有益效果：在抗旱育种过程种，通过将上述水稻抗旱调控蛋白DT1的表达的物质导入水稻，可以显著提高水稻的抗旱性。水稻抗旱调控蛋白DT1的作用使得其发现和相关突变体的鉴定以及对水稻抗旱分子育种具有重要的应用价值。通过设计不同的水稻抗旱调控蛋白DT1敲除靶标位点，利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除载体，转化水稻细胞，获
得DT1基因敲除纯合突变体。相比对照，不同突变体的抗旱性显著增强。因此，本专利技术提供的敲除水稻抗旱调控蛋白DT1以增加抗旱性的方法，具有重要的应用价值，对水稻抗旱遗传改良具有重要的意义。
附图说明
[0012]图1为实施例1中野生型Dongjin与突变体dt1的抗旱表型图；WT：野生型；Before drought:：干旱处理前；drought：干旱处理中；After drought：干旱处理后；Survival rate：存活率。
[0013]图2为实施例1中野生型和突变体dt1的叶片气孔扫描电镜观察图；图中，A、B是野生型水稻正常生长的叶片气孔形态图；E、F是野生型水稻干旱胁迫下的叶片气孔形态图；C、D是dt1的水稻正常生长的叶片气孔形态图；G、H是dt1的水稻干旱胁迫的叶片气孔形态图。
[0014]图3为是实施例1中突变体dt1的T
‑
DNA插入位点鉴定图；WT：野生型；OsARF19 expression level：OsARF19表达水平。
[0015]图4为是实施例2中CRISPR/Cas9敲除蛋白DT1的抗旱表型图；NPB：水稻日本晴；Survival rate：存活率。
具体实施方式
[0016]下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。
[0017]实施例1水稻抗旱突变体dt1的表型鉴定
[0018]从购自韩国庆熙大学的水稻品种Dongjin T
‑
DNA插入突变体库(https://orygenesdb.cirad.fr/)中筛选获得抗旱突变体dt1(drought tolerance 1)。
[0019]与野生型相比，突变体dt1表现抗旱的表型(图1)。相比野生型，突变体植株在干旱处理后的存活率显著高于野生型(图1)。
[0020]取正常生长2周与干旱胁迫处理3天的野生型和突变体叶片，切成小块。用2.5％戊二醛固定液固定24小时，再用1％锇酸固定6小时，利用扫描电子显微镜观察。扫描电镜结果表明，在正常生长的条件下野生型和突变体气孔开闭无差异，但在干旱胁迫下野生型和突变体气孔开闭存在显著差异(图2)。
[0021]综上所述，相比野生型，突变体dt1在干旱胁迫下叶片气孔关闭，进而增强植物抗旱性。
[0022]实施例2DT1的克隆与CRISPR
‑
Cas9敲除验证
[0023]1、DT1的克隆
[0024]为了分离鉴定出控制突变体dt1的抗旱的基因，根据T
‑
DNA插入的侧翼序列设计三条检测引物P1(如SEQ ID No.3所示，ttgtaagcggcaagagg)、P2(如SEQ ID No.4所示，ccatttatggaaaagtgag)和P3(如SEQ ID No.5所示，atcaattccagttttcg)(图3A)。PCR扩增结果表明，引物P1+P2在野生型中能扩增出目的片段，而在dt1中则不能。同时，引物P2+P3在dt1中可以扩增出目的片段，而在野生型中则不能(图3B)，结合DNA测序，发现T
‑
DNA插在基因OsARF19第八外显子上(图3A)，OsARF19翻译表达的蛋白为DT1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。根据已公布的水稻日本晴基因组序列，结合基因测序，获得了如SEQ ID No.1所示的编码DT1蛋白的基因OsARF19全长cDNA序列。
[0025]SEQ ID No.1基因OsARF19全长cDNA序列：
[0026]atgatgaagcaggcgcagcagcagccgccgccgccaccggcgagctctgcggcgacgacgaccaccgcgatggcagccgctgcggcggcggcggtggtggggagcgggtgcgaaggggagaagacgaaggc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用，其特征在于，所述水稻DT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.如权利要求1的应用，其特征在于，所述水稻DT1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。3.如权利要求1的应用，其特征在于，所述应用为下调水稻DT1蛋白的表达在提高水稻抗旱能力中的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜，曹鹏辉，董丹，陈文静，冯亚婷，杜坛潇，郜素，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：