一种用于茶树基因功能研究的VIGS方法技术

本发明专利技术涉及一种用于茶树基因功能研究的VIGS方法，选择茶树实生苗，去除顶芽和部分真叶，进行真空侵染，所述真空侵染条件为：侵染压强为0.7

【技术实现步骤摘要】
一种用于茶树基因功能研究的VIGS方法


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种用于茶树基因功能研究的VIGS方法。

技术介绍

[0002]茶树属山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物，在我国已经有几千年的栽培历史，是我国的一种重要的经济树种。茶因富含茶多酚、茶氨酸及咖啡碱等多种特征性次生代谢物，具有卓越的保健功效及优异的风味品质。为精确研究与茶树优良性状相关基因的功能，提升突破性茶树新品种的选育效率，创建新的茶树品种，亟需建立一套高效、稳定、简单的茶树基因功能研究体系。现阶段，茶树基因功能验证大多依赖拟南芥和烟草等模式植物的异源表达系统。然而，生物合成网络的复杂性和多样性，往往使得异源表达系统不适用于茶树特征基因功能鉴定。而茶树基因功能基础研究的缺失，也制约了生产上急需的突破性新品种定向选育，由于茶树体胚富含多酚类物质，且体胚的诱导、成熟和萌发时间较长，使得茶树组织培养过程中存在严重的褐化现象，且可重复性差，因此依赖于组织培养的茶树转基因体系普遍实施周期长、转化率低，难以获得转基因植株。

技术实现思路

[0003]为解决上述问题，本研究采用去顶芽和部分真叶的茶树实生幼苗(母本福鼎大白茶、父本龙井43)为转化受体，利用根瘤农杆菌GV3101真空侵染茶苗伤口，经表型观察和基因表达量分析获得茶树沉默基因植株。该茶树VIGS方法将为茶树基因功能研究和种质创新奠定坚实的基础。
[0004]一种用于茶树基因功能研究的VIGS方法，包括以下步骤；
[0005]1)目的基因的获得，
[0006]2)pTRV2
‑
目的基因载体的构建，
[0007]3)pTRV2
‑
目的基因载体热击法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，
[0008]4)冻融法将含有载体的质粒导入农杆菌GV3101，
[0009]5)选择侵染材料，
[0010]6)真空侵染，
[0011]7)暗培养和光照培养侵染茶苗后，常规培养；
[0012]所述侵染材料为长出3
‑
4枚真叶且没有木质化的实生茶苗，侵染前去除实生茶苗的顶芽和所有叶片，所述真空侵染条件为：侵染压强为0.7
‑
0.8kPa、菌液浓度D600为1.2O；侵染时间为0.5
‑
1h，所述菌液为体积比1：1的含pTRV1载体与pTRV2
‑
目的基因载体的重悬液的混合菌液。
[0013]所述真空侵染条件为：侵染压强为0.7kPa、菌液浓度D600为1.2O；侵染时间为0.5
‑
1h。
[0014]所述重悬液配制方法，4.74g的MS、2ml的6
‑
BA、30g的蔗糖、100ul的NAA、溶于1L蒸馏水中，调pH为5.6，121℃高温高压灭菌21min后，在超净台中加入0.2g乙酰丁香酮AS，
‑
20
℃保存。
[0015]所述侵染前将除去顶芽和所有叶片的实生茶苗置于混合菌液中浸泡1
‑
2小时。
[0016]所述茶树品种为福鼎大白茶。
[0017]所述实生茶苗的培养方法为将茶树种子去除种皮放在催芽液中,在25℃，在16h光照/8h黑暗循环的人工气候室中萌发生长3
‑
5周，所述催芽液为6
‑
BA 100ul/L+赤霉素600ul/L+氯霉素5ml/L。
[0018]所述暗培养和光照培养采用保鲜膜覆盖侵染茶苗，在保持湿润环境下培养。
[0019]培养条件：培养室昼夜光周期为光/暗:16h/8h，温度为光/暗:25℃/18℃，相对湿度为65％，光源为日光灯。
[0020]所述目的基因为CsPOR1(原叶绿素求酸酯氧化还原酶1)基因，常规培养直至出现沉默的白化表型。
[0021]本专利技术标记基因的选择：利用CsPOR1(原叶绿素求酸酯氧化还原酶1)基因作为标记基因，该基因合成的酶是唯一能够将原叶绿素酸酯转化为叶绿素酸酯的酶，控制叶绿素a和叶绿素b合成，CsPOR1沉默后叶片会出现光漂泊现象，所以可以选择它作为标记基因。
[0022]载体的选择：本专利技术采用烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)载体，属于RNA病毒,病毒粒体呈直杆状,有2种粒体,长粒体190～210nm
×
25nm,短粒体40～80nm
×
20～25nm。该病毒基因组中含有两条RNA链:RNA1和RNA2。RNA1能编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase,RdRp)基因、运动蛋白(movementprotein,Mp)以及富含半胱氨酸的蛋白质；RNA2能编码衣壳蛋白(coatprotein,Cp)以及克隆目标基因的酶切位点,病毒颗粒极其稳定。RNA1和RNA2两条链构成双元载体,因此TRV介导的基因沉默需要RNA1和RNA2的同时作用。当采用农杆菌侵染方法时,两个载体分别被转入到各自独立的农杆菌中,两者混合后对植物进行共侵染。与其他病毒载体相比,TRV载体侵染方便快捷,侵染后数天就可沉默目的基因,与通量克隆技术结合,TRV还能实现目的基因的高通量功能分析。
[0023]本专利技术优选真空抽滤法进行真空侵染，适当选择侵染压强和菌液浓度，配制最适的农杆菌生长的培养基、调节适宜于茶树生长的PH值、调整营养元素、植物生长调节剂对茶苗生长的影响，提高茶树VIGS方法的沉默效率；在暗培养和光照培养过程中的温度、湿度、光源等条件可自行调节，最终茶苗可以在5
‑
6周时出现沉默的白化表型，达到研究茶树内源基因的目的。
[0024]本专利技术的茶树VIGS方法通过真空侵染的方式对茶苗进行侵染，侵染过程相对传统的遗传转化操作简单、用时少，不需要经过组织培养获得转基因植株，反向的弥补茶树没有完整遗传转化的不足。本专利技术中的茶树VIGS方法在真空侵染过程中控制合适的压强、OD600、侵染时间三者，将含目的片段的TRV(烟草脆裂病毒)载体导入茶树植株，使得茶树表现出沉默表型验证基因功能，该方法避免茶树内源基因在异源模式生物中不能完全表达或不表达的问题，为研究茶树基因功能和茶树种质创新开辟了一条新道路。
附图说明
[0025]图1为CsPOR1基因PCR扩增；
[0026]图2为农杆菌中含有ptrv1、pTRV2、pTRV2
‑
CsPOR1载体DNA的PCR扩增；
[0027]图3为25d到45d TRV:00组和TRV:POR1组表型变化；
[0028]图4为TRV:00组、TRV:POR1组表型对比；
[0029]图5为55d TRV:00组和TRV:POR1组叶片表型对比；
[0030]图6为野生型、空载组、实验组茶树叶片中CsPOR1基因的相对表达量；
[0031]图7为空载组与实验组CsPOR1基因表达量随时间变化；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于茶树基因功能研究的VIGS方法，包括以下步骤；1)目的基因的获得，2)pTRV2
‑
目的基因载体的构建，3)pTRV2
‑
目的基因载体热击法转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，4)冻融法将含有载体的质粒导入农杆菌GV3101，5)选择侵染材料，6)真空侵染，7)暗培养和光照培养侵染茶苗后，常规培养；所述侵染材料为长出3
‑
4枚真叶且没有木质化的实生茶苗，侵染前去除实生茶苗的顶芽和所有叶片，所述真空侵染条件为：侵染压强为0.7
‑
0.8kPa、菌液浓度D600为1.2O；侵染时间为0.5
‑
1h，所述菌液为体积比1：1的含pTRV1载体与pTRV2
‑
目的基因载体的重悬液的混合菌液。2.根据权利要求1所述的方法，所述真空侵染条件为：侵染压强为0.7kPa、菌液浓度D600为1.2O；侵染时间为0.5
‑
1h。3.根据权利要求1所述的方法，所述重悬液配制方法，4.74g的MS、2ml的6
‑
BA、30g的蔗糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕立堂，李国栋，姚新转，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：