基于单域抗体9-4-1免疫磁珠的直扩检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于单域抗体9

【技术实现步骤摘要】
基于单域抗体9
‑4‑
1免疫磁珠的直扩检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及一种免疫磁珠试剂盒，特别涉及一种基于单域抗体免疫磁珠的直扩检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其用途，本专利技术属于生物


技术介绍

[0002]小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)又称为羊瘟、小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎等，是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的以发热、肺炎、腹泻、呼吸困难等为主要临床症状，发病率、死亡率可分别高达100％、90％。2007年6月，我国首次报道西藏阿里地区暴发小反刍兽疫疫情，随后陆续蔓延至新疆、甘肃、内蒙等20多个省份，并且疫情传播速度快、跨度大、风险高，给我国养殖业造成了巨大的经济损失。疫苗的使用有效控制了疫情的大面积爆发，但近几年，PPRV的发生几乎没有间断过，羊的重要疫病流行病学调查发现，PPRV在北方野生岩羊群中的持续性带毒是引发当前PPRV频频散发或区域性流行的关键因素(Lingxia Li,et al.Epidemic and Evolutionary Characteristics of Peste des Petits Ruminants Virus Infecting Procapra przewalskii inWestern China，Infection,Genetics and Evolution,2019)。这一结果给检测带来了新的挑战，持续带毒检测的难点在于机体病毒含量低、干扰因素复杂，极易造成漏检，从而给准确诊断和分离病原带来一定困难。
[0003]单域抗体是抗体分子的最小抗原结合单元，仅由一个可变结构域或一个仅协助靶标结合的工程化的恒定结构域组成，不含普通抗体的Fc段，因此，单域抗体能够避免由Fc段引起的补体反应，故越来越多地应用于生物探测、诊断、制药等领域。而免疫磁珠技术(Immunomagnetic beads,IMB)是一种以抗原抗体反应为基础，以磁载体技术为媒介的新型诊断技术。经过一定处理将抗体结合在磁珠上，作为抗体载体的磁珠与抗原物质结合后，形成免疫复合物，在磁铁磁力的作用下，这种复合物发生力学移动，将与磁殊上抗体特异性结合的抗原与其它物质分离。此技术已应用于免疫检测、细胞分离、蛋白质纯化等方面。由于其特有的快速、高效、低毒、特异性高、操作简单等特点为抗原检查隐性感染提供了新思路。
[0004]本专利技术将单域抗体进行优化后与免疫磁珠技术结合起来，无需复杂的纯化设备和技术，对样品的澄清度也无限制，只需要简单的磁性吸附步骤即可很方便地检测低微含量小反刍兽疫病毒，从而建立了一种检测速度快、特异性和灵敏度高、重复性好的免疫检测技术。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中存在的小反刍兽疫病毒抗原检测过程中由于病毒含量低微，无法达到PCR或Real
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time
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PCR检测最低要求而出现假阴性结果以及提取RNA费时、费力，购买RNA提取试剂盒耗资等一系列难题，本专利技术一方面利用切胶纯化方法制备了高纯度单域抗体蛋白，较普通方法制备蛋白纯度更好，更利于标记，标记后的免疫磁珠富集小反刍兽疫病
原的特异性更强；另一方面免去基因组RNA提取这一关键环节，直接扩增富集产物进行实时荧光定量检测，节省时间，节省人力、物力、财力，提高经济效益。
[0006]具体的，为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0007]本专利技术的一种基于单域抗体9
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1免疫磁珠的直扩检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包括小反刍兽疫病毒单域抗体9
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1通过链霉亲和素
‑
生物素(SA
‑
Biotin)与磁珠进行抗体偶联得到的单域抗体9
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1免疫磁珠，所述的小反刍兽疫病毒单域抗体9
‑4‑
1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]其中，优选的，所述的小反刍兽疫病毒单域抗体9
‑4‑
1由保藏编号为CCTCC NO.M 2019740，保藏名称为大肠杆菌9
‑4‑
1/PPRV(Escherichia coli 9
‑4‑
1/PPRV)的菌株产生，并通过切胶纯化的方法获得。
[0009]其中，优选的，所述的试剂盒还包括用于直扩检测小反刍兽疫病毒的上游引物、下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列分别为：
[0010]上游引物：5
’‑
GAGGGGAGTAGAGATGAAGACGAG
‑3’
；
[0011]下游引物：5
’‑
ATAATTGGAAAGGCGGGCTAAGAC
‑3’
；
[0012]探针：5
’‑
GAGCTTGCAAGTTTCCTAATGGATCGG
‑3’
。
[0013]其中，优选的，所述的上、下游引物以及探针的浓度均为10μM。
[0014]其中，优选的，所述的试剂盒还包括直扩反应液。
[0015]其中，优选的，使用所述的试剂盒用于检测小反刍兽疫病毒抗原时，按照以下步骤进行：
[0016]1)病毒的富集：取单域抗体9
‑4‑
1免疫磁珠10μl于1.5mL的EP管中，加入离心后待检样本上清100μl，震荡混匀，置于4℃冰箱，富集12h或过夜；
[0017]2)磁珠的洗涤：待病毒富集完成后，将EP管放置于磁力架上，弃去上清，用1ml pH值7.6，0.05M的PBS缓冲液洗涤3次，最后用50μl PBS缓冲液重悬，得到混悬液为富集病毒的产物；
[0018]3)建立50μl直扩反应体系：直扩反应液40μl，上、下游引物和探针混合液5μl，混悬液5μl；扩增程序为：50℃15min；95℃10min；95℃10s，60℃30s，72℃30s，5个循环预扩增；95℃10s，51℃30s，共进行40个循环并采集荧光；
[0019]所述引物、探针的序列分别为：
[0020]上游引物：5
’‑
GAGGGGAGTAGAGATGAAGACGAG
‑3’
；
[0021]下游引物：5
’‑
ATAATTGGAAAGGCGGGCTAAGAC
‑3’
；
[0022]探针：5
’‑
GAGCTTGCAAGTTTCCTAATGGATCGG
‑3’
。
[0023]进一步的，本专利技术还提出了所述的试剂盒在制备检测小反刍兽疫病毒抗原试剂中的应用。
[0024]相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0025]本专利技术的提出克服了小反刍兽疫病毒抗原检测过程中病毒含量低微，无法达到RT
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于单域抗体9
‑4‑
1免疫磁珠的直扩检测小反刍兽疫病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括小反刍兽疫病毒单域抗体9
‑4‑
1通过链霉亲和素
‑
生物素(SA
‑
Biotin)与磁珠进行偶联得到的单域抗体9
‑4‑
1免疫磁珠，所述的小反刍兽疫病毒单域抗体9
‑4‑
1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的小反刍兽疫病毒单域抗体9
‑4‑
1由保藏编号为CCTCC NO.M 2019740，保藏名称为大肠杆菌9
‑4‑
1/PPRV(Escherichia coli 9
‑4‑
1/PPRV)的菌株产生，并通过切胶纯化的方法获得。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括用于直扩检测小反刍兽疫病毒的上游引物、下游引物和探针，所述上游引物、下游引物和探针的序列分别为：上游引物：5
’‑
GAGGGGAGTAGAGATGAAGACGAG
‑3’
；下游引物：5
’‑
ATAATTGGAAAGGCGGGCTAAGAC
‑3’
；探针：5
’‑
GAGCTTGCAAGTTTCCTAATGGATCGG
‑3’
。4.如权利要求1所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴锦艳，尚佑军，田宏，侯俊玲，吕律，刘永杰，何继军，李玲霞，杜国玉，张成，孙健飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：