本发明专利技术公开了一种试剂组、试剂盒及利用其进行免疫检测的方法。还公开了一种胶乳增强免疫比浊法试剂的制备方法，其包括以下步骤：将大粒径和小粒径胶乳微球分别活化后，将抗待测物的抗体加入大粒径胶乳微球中，待测物蛋白复合物加入小粒径胶乳微球中，进行偶联反应；反应液分别经封闭、离心、复溶和重悬后，即得包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂，和，包含待测物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂。本发明专利技术的试剂盒包括：所述R1试剂、R2试剂和校准品。本发明专利技术充分发挥了不同粒径胶乳微球的优势，极好地克服了现有方法存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题，具有测值准确，操作简单、快速，可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点。优点。
【技术实现步骤摘要】
一种试剂组、试剂盒及利用其进行免疫检测的方法
[0001]本专利技术属于医学检测领域，具体地，涉及一种试剂组、试剂盒及利用其进行免疫检测的方法。
技术介绍
[0002]胶乳增强免疫比浊法(Latex enhanced turbidimetric immunoassay，LETIA)通过共价偶联或物理吸附等方式，将抗体或抗原偶联到纳米尺寸的胶乳微球表面，形成胶乳微球
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抗体或胶乳微球
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抗原复合物。所述复合物与样本中的待测抗原或待测抗体高度特异性免疫结合反应，使胶乳微球表面的抗体或抗原与标本所含的待测物反应而形成微球聚集体，在反应过程中起到增强信号的作用，可以将检测的灵敏度提高好几个数量级，达到准确的定量效果。
[0003]胶乳增强免疫比浊可采用竞争法和非竞争法两种模式，竞争法可用于大分子待测物，也可用于小分子待测物，而非竞争法一般仅用于检测含有多个抗原表位的蛋白类待测物。小分子待测物由于分子量的限制，一般难以建立非竞争免疫比浊检测方法，而只有采用竞争免疫比浊的方式实施检测。竞争法胶乳增强比浊法是指样本所含待测物与检测体系固定量的待测物竞争结合限量的抗待测物抗体，使免疫反应体系在某特定波长下的吸光值(A)发生变化，通过测定该变化计算样本中小分子待测物的浓度，达到疾病诊断、筛查、监测等临床目的。
[0004]胶乳免疫比浊试剂中，灵敏度高低，直观的表现为吸光度信号值变化率高低及其测试重复稳定性，可以间接的通过最低检测限(Limit of Detection，简称LOD)来表述，即LOD越低，灵敏度越高。而线性范围是指按说明书使用可准确测量的范围，是衡量试剂盒质量的重要指标，也是保证使用和鉴定试剂盒的关键指标之一。
[0005]表面带有羧基官能团的聚苯乙烯(PS)纳米胶乳微球是LETIA试剂常用的载体，目前市售的胶乳增强免疫比浊法试剂主要是用单一粒径胶乳微球。选择粒径小的胶乳微球，微球的蛋白载量大，可以偶联更多的免疫结合试剂，往往可以获得更宽的待测物测量浓度范围，精密度和线性相对较好，检测的线性范围可覆盖高值区域。然而，小粒径微球的凝集导致的A值增量相对较小，检测灵敏度也相应较低，对于样本中含量极微的待测物，尤其是对于样本中含量极微且需要采用竞争免疫分析方式检测的小分子待测物，使用小粒径微球常常难以实现高灵敏检测，测值不准确，变异系数(CV)值过大。而选择粒径大的微球，所需的抗体量较少，能够有效增加吸光度信号值，成倍提高试剂灵敏度，有利于低值的检测以达到灵敏度的要求，但是会导致试剂空白过高，精密度和线性相对较差，微球检测的线性范围不够，因此高值检测不准确，而且大粒径胶乳通常会降低试剂线性范围和抗原过剩能力，且大粒径胶乳生产工艺更难控制。
技术实现思路
[0006]为克服现有技术的胶乳增强免疫法存在低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的
问题，本专利技术提供了一种提高胶乳增强免疫比浊法线性范围和灵敏度的方法，该方法选用两种平均粒径不同的羧基化胶乳微粒，利用化学交联法使两种不同粒径大小的荧光微球同时偶联抗原复合物和抗体，充分发挥不同粒径胶乳微球的优势，极好地克服了胶乳增强免疫法存在的低值灵敏度和检测线性范围无法兼顾的问题。本专利技术还提供一种具有高灵敏度和宽线性范围的试剂及试剂盒，其包括：试剂1(R1)、试剂2(R2)和校准品，具有测值准确，操作简单、快速，可用于门急诊检测且仪器适用面广等优点。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术使用的技术方案之一为：一种胶乳增强免疫比浊法试剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0008](1)大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球分别与活化缓冲液混匀后加入活化剂进行活化；
[0009](2)将抗待测物的抗体加入活化后的大粒径胶乳微球中，将待测样本与蛋白制备成待测物蛋白复合物后加入活化后的小粒径胶乳微球中，分别进行偶联反应；
[0010](3)向偶联反应后的反应液中加入封闭液进行封闭，封闭后弃上清，固形物分别用缓冲液复溶并重悬，即得包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂，和，包含待测物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂；
[0011]其中，所述的胶乳微球为疏水微球，表面带有负电荷的羧基；所述的大粒径胶乳微球固体含量为5％
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10％；粒径为275
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310nm；所述的小粒径胶乳微球固体含量为5％
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10％；粒径为70
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90nm。
[0012]在一些实施方案中，步骤(1)中，所述的活化缓冲液为MES缓冲液；和/或，所述的活化剂为NHS和EDC；和/或，胶乳微球:NHS:EDC的总质量比为7:10:1；和/或，所述活化的温度为37℃，反应时间为30
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60min；和/或，步骤(3)中，封闭后通过离心弃上清；
[0013]在一些优选的实施方案中，所述胶乳微球为羧基聚苯乙烯胶乳微球；和/或，所述的大粒径胶乳微球固体含量为10％，粒径为275nm；和/或，所述的小粒径胶乳微球固体含量为5％，粒径为70nm；和/或，步骤(1)中，所述MES缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为6.1；和/或，步骤(3)中，所述的离心的转速为16,000rpm，时间为40min。
[0014]在一些实施方案中，步骤(2)中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的任意一种；所述的待测物蛋白复合物为药物与钥孔血蓝蛋白的复合物；和/或，所述偶联反应的温度为25℃，反应时间为10
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90min；优选地，所述的待测物为他克莫司、雷帕霉素或环孢霉素。
[0015]在一些实施方案中，所述的抗体经缓冲液稀释后的浓度为0.5
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5mg/mL；优选1mg/mL；和/或，所述的待测物蛋白复合物经缓冲液稀释后的浓度为20
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100μg/mL；优选50μg/mL。
[0016]在一些实施方案中，步骤(3)中，所述的封闭液为牛血清白蛋白、甘氨酸或乙醇胺；和/或，所述封闭的温度为37℃，时间为30
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60min，优选在震荡的条件下封闭，例如120rpm。
[0017]在一些实施方案中，步骤(3)中，复溶抗体偶联的大粒径胶乳微球所用的缓冲液(本专利技术中又称为R1缓冲液)的成分包括：
[0018]‑
50
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100mmol/L HEPES或Tris或PBS；优选100mmol/L HEPES；
[0019]‑
1％NaCl；
[0020]‑
防腐剂：0.1％NaN3或Procline300或硫柳汞；优选0.1％Procline300；
[0021]‑
保护剂：1
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5％海藻糖和0.1
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0.5％甘氨酸；优选2％海藻糖和0.2％甘氨酸；
[0022]pH值为7.0
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8.0；优选pH值为7.4；和/或，
[0023]复溶待测物蛋白复合物偶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种胶乳增强免疫比浊法试剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球分别与活化缓冲液混匀后加入活化剂进行活化；(2)将抗待测物的抗体加入活化后的大粒径胶乳微球中，将待测样本与蛋白制备成待测物蛋白复合物后加入活化后的小粒径胶乳微球中，分别进行偶联反应；(3)向偶联反应后的反应液中加入封闭液进行封闭，封闭后弃上清，固形物分别用缓冲液复溶并重悬，即得包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂，和，包含待测物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂；其中，所述的胶乳微球为疏水微球，表面带有负电荷的羧基；所述的大粒径胶乳微球固体含量为5％
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10％，粒径为275
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310nm；所述的小粒径胶乳微球固体含量为5％
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10％，粒径为70
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90nm。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的活化缓冲液为MES缓冲液；和/或，所述的活化剂为NHS和EDC；和/或，胶乳微球:NHS:EDC的总质量比为7:10:1；和/或，所述活化的温度为37℃，反应时间为30
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60min；和/或，步骤(3)中，封闭后通过离心弃上清；优选地，所述胶乳微球为羧基聚苯乙烯胶乳微球；和/或，所述的大粒径胶乳微球固体含量为10％，粒径为275nm；和/或，所述的小粒径胶乳微球固体含量为5％，粒径为70nm；和/或，步骤(1)中，所述MES缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为6.1；和/或，步骤(3)中，所述的离心的转速为16,000rpm，时间为40min。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的任意一种；所述的待测物蛋白复合物为药物与钥孔血蓝蛋白的复合物；和/或，所述偶联反应的温度为25℃，反应时间为10
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90min；优选地，所述的待测物为他克莫司、雷帕霉素或环孢霉素。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的抗体经缓冲液稀释后的浓度为0.5
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5mg/mL，优选1mg/mL；和/或，所述的待测物蛋白复合物经缓冲液稀释后的浓度为20
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100μg/mL，优选50μg/mL。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的封闭液为牛血清白蛋白、甘氨酸或乙醇胺；和/或，所述封闭的温度为37℃，时间为30
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60min，优选在震荡的条件下封闭，例如120rpm。6.如权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小慧，林巍靖，
申请(专利权)人：上海健耕医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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