一种通过定向结合抗体Fc位点有效减小位阻的免疫检测方法技术

本发明专利技术公开了一种通过定向结合抗体Fc位点有效减小位阻的免疫检测方法。其包括以下步骤：(1)将带有次氮基三乙酸的N

【技术实现步骤摘要】
一种通过定向结合抗体Fc位点有效减小位阻的免疫检测方法


[0001]本专利技术属于免疫学检测
，具体地，涉及一种通过定向结合抗体Fc位点有效减小位阻的免疫检测方法。

技术介绍

[0002]NTA
‑
Ni
‑
His标签：
[0003]1987年，Hochuli等人专利技术了改进的金属螯合配体次氮基三乙酸(NTA)，伴随着现代分子生物学和重组蛋白技术的高速发展，NTA配体在纯化组氨酸标签(his
‑
tagged)蛋白方面得到了很重要的应用。
[0004]众所周知，广泛使用的金属离子为Ni
2+
，其周围共有六个配位点供配体结合。IDA是三齿配体，即可以结合Ni
2+
周围的三个配位点，剩余的三个配位点中两个用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基，另一个用于和H2O配位结合，因此，IDA对Ni
2+
的结合能力相对较弱，造成结合到介质上的Ni
2+
容易脱落，致使介质的性能不稳定。而NTA是四齿配体，即NTA可以结合Ni
2+
周围的四个配位点，剩余两个配位点用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基。
[0005]Fc受体蛋白：
[0006]Fc受体指一系列细胞膜表面能与IgFc片段结合的受体。在免疫学中，具有Fc受体细胞一般有B细胞、杀伤细胞、巨噬细胞。抗体是由免疫细胞产生的特殊蛋白质，可以与抗原如微生物、毒素或过敏物质结合。当免疫细胞上的Fc受体与抗体及其附着的抗原结合时，可以引发吞噬作用，这样会消耗被抗体包被的抗原。
[0007]基于不同类型的抗体，会存在不同的特异性抗原。这也意味着也存在不同的Fc受体，每个Fc受体能够在其Fc区结合抗体。抗体也称为免疫球蛋白，简称Ig，并且最常见于血液中的IgG类型。Fc受体主要分为三类，包括Fc
‑
γ受体，Fc
‑
α受体和Fc
‑
ε受体。每种类型的Fc受体包含基于遗传同源性的几种亚型，例如Fc
‑
γ受体可结合IgG的Fc片段，Fc
‑
α受体可结合IgA的Fc片段，Fc
‑
ε受体可结合IgE的Fc片段。
[0008]传统双抗体夹心法：
[0009]双抗体夹心法，最早用于酶联免疫吸附测定法(ELISA)。传统双抗体夹心法是将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板的小孔里，洗涤一次后，加入待测抗原，若已知抗体和待测抗原是特异的，则两者发生结合，再加入与待测抗原呈特异性反应的酶联抗体，使一单位的抗原同时结合两单位的抗体形成“夹心”；最后加入该酶的底物，根据产生的有色酶解产物颜色的深浅来判断待测抗原的含量。双抗体夹心法可在多种技术平台，如时间分辨技术平台、化学发光技术平台等中应用。只要是使一单位的抗原同时结合两单位的抗体形成“夹心”，都是基于双抗体夹心法的应用。但是，传统双抗体夹心法是通过物理吸附或者化学偶联的方法结合抗体，抗体无规则吸附或者结合于微孔板底部，而抗体的Fab段会受到位阻影响，无法充分暴露出特异性位点，从而影响检测的灵敏度和线性。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供一种通过定向结合Fc位点有效减小位阻的免疫检测方法。该方法基于双抗体夹心检测技术，通过定向结合抗体Fc位点，使抗体的Fab区域充分暴露，从而有效地减小抗体与结合位点的位阻，明显提高了传统双抗体夹心法的检测灵敏度和线性。传统基于双抗体夹心法的免疫检测技术与本专利技术基于双抗体夹心法的免疫检测技术的对比见图1。
[0011]为克服上述传统双抗体夹心法存在的缺点和不足，本专利技术通过聚苯乙烯微孔板化学偶联NTA，NTA与带有His标签的Fc受体共同配位结合Ni离子，Fc受体通过特异结合对应型抗体的Fc片段，形成稳定的聚苯乙烯微孔板
‑
NTA
‑
Ni
‑
His
‑
Fc受体
‑
抗体结构(图2)。
[0012]本专利技术的技术方案如下：
[0013]本专利技术提供的技术方案之一为：一种免疫检测方法，其包括以下步骤：
[0014](1)将带有次氮基三乙酸(NTA)的N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸与镍离子混合形成螯合配位体；
[0015](2)将所述螯合配位体与带有组氨酸(His)标签的Fc受体混合。
[0016]在一些优选实施方案中，如技术方案之一所述的步骤(1)包括如下步骤：
[0017]1‑
1)将表面活性剂溶液平铺在微孔反应板内，2
‑
8℃静置包被过夜；甩去表面活性剂溶液后室温晾干，用(10mM
‑
50mM，优选20mM；pH 5.8
‑
6.5，优选6.1)2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸缓冲液(MES)溶解1％N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.1％1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(EDC)，加入微孔反应板，室温摇匀10min；加入N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸，37℃反应30min，去离子水洗涤3次；加入30
‑
50mM伯胺(如羟胺、乙醇胺、甘氨酸)封闭1h，去离子水洗涤3次；
[0018]1‑
2)加入镍离子盐混匀，室温摇匀60min，去离子水洗涤3次。
[0019]在一些优选实施方案中，如技术方案之一所述的步骤(2)包括如下步骤：
[0020]2‑
1)将6
×
His
‑
Fc受体溶液(浓度0.005％
‑
0.05％，优选0.02％，0.1MPBS，pH 7.4基质中)加入上述微孔反应板，反应1
‑
3h，用0.1M，pH 7.4的PBS缓冲液洗涤5次；加入抗待测物的抗体，反应1h，用0.1M，pH 7.4的PBS缓冲液洗涤5次；所述的抗待测物的抗体的质量百分比浓度为优选0.005％
‑
0.05％；更优选0.02％；
[0021]2‑
2)加入5％
‑
30％(优选10％)的甘油溶液(含防腐剂0.05％，叠氮化钠或硫柳汞均可)静置封闭2h后，甩干，置于阴凉处晾干备用。
[0022]在一些优选实施例中，所述的微孔反应板为聚苯乙烯材料的微孔反应板。
[0023]在一些优选实施例中，如技术方案之一所述的步骤(1)中，所述的表面活性剂为具有特征结构的聚丙烯酸类表面活性剂，其可在聚苯乙烯表面形成一层羧基层；优选Eudragit L100
‑
55、聚丙烯酸、聚苯乙烯
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：(1)将带有次氮基三乙酸的N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸与镍离子混合形成螯合配位体；(2)将所述螯合配位体与带有His标签的Fc受体混合。2.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：1
‑
1)将N
‑
羟基琥珀酰亚胺和1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺溶于2
‑
(N
‑
吗啉)乙磺酸缓冲液，加入铺有表面活性剂的微孔反应板内混匀，加入N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸混匀，去离子水洗涤；加入伯胺封闭，去离子水洗涤；1
‑
2)加入镍离子盐混匀，去离子水洗涤。3.如权利要求2所述的免疫检测方法，其特征在于，步骤(2)包括如下步骤：2
‑
1)将6
×
His
‑
Fc受体溶液加入微孔反应板，反应1
‑
3h，用PBS缓冲液洗涤；加入抗待测物的抗体，反应1h，用PBS缓冲液洗涤；所述的抗待测物的抗体的质量百分比浓度优选0.005％
‑
0.05％；更优选0.02％；2
‑
2)加入甘油溶液静置封闭，晾干备用。4.如权利要求2或3所述的免疫检测方法，其特征在于，所述的微孔反应板为...

【专利技术属性】
技术研发人员：林巍靖，郁梦佳，顾冬兰，
申请(专利权)人：上海健耕医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：