低位阻胶乳增强免疫竞争法定量测定全血中他克莫司的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种低位阻胶乳增强免疫竞争法定量测定全血中他克莫司的试剂盒，其包括致敏胶乳试剂，所述致敏胶乳试剂包含胶乳微球

【技术实现步骤摘要】
低位阻胶乳增强免疫竞争法定量测定全血中他克莫司的试剂盒


[0001]本专利技术属于生化检测领域，具体涉及一种低位阻胶乳增强免疫竞争法定量测定全血中他克莫司的试剂盒。

技术介绍

[0002]他克莫司(tacrolimus，FK506，又名：普乐可复、大环哌南)是从土壤真菌中提取的一种大环内酯类抗生素，具有较强的免疫抑制特性，其药物强度是环胞霉素A的10
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100倍，预防各种器官移植所出现的排斥反应的效果优于环孢菌素。
[0003]1984年，日本藤泽公司(Fujisawa)在日本大阪筑波地区分离出筑波链霉菌，通过酦酵、纯化及分离出Tacrolimus成分。1989年，美国匹兹堡大学Starzl器官移植中心将普乐可复首次在临床试用。1993年，在日本以普乐可复(Prograf)上市。1995年经FDA获准后在多个国家正式使用。目前，普乐可复已广泛的应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏、肺等实体器官的移植中。根据美国匹兹堡大学报告，在使用环孢素无效的援救疗法中，肝移植患者应用FK506有87％的成功率，而肾移植患者有74％成功率。1999年在中国上市以来，到目前为止，使用过该产品的移植患者累积已超过5000例人数，基本上每个移植中心和单位都应用普乐可复产品。2002年该品的全国医院用药金额为3.4亿元，占整个免疫抑制剂的5.44％；2003年为5.4亿元，占整个免疫抑制剂的8.17％。该品种在全国畅销药品徘名中名列第70位，居免疫抑制剂的第4位。但由于其价格昂贵，大多数患者经济上无法承受，使其应用受限。值得关注的是，该类产品中由安徽金蟾药业独家生产的华蟾素。它是一种治乙肝、抗肿瘤纯中药制剂，现已在北京、上海、广州等地大医院得到普遍应用。
[0004]他克莫司的疗效、不良反应与其血药浓度密切相关,血药浓度太高会增加不良反应发生率,血药浓度太低又增加排斥风险,因此须将其血药浓度控制在疗效最优,不良反应最低的范围,通过血药浓度检测(TDM)来指导个体化用药,所用的剂量须因人而异,针对不同患者的具体情况制定出最佳给药剂量,尽可能获得最佳效果、减少不良反应。
[0005]目前，检测FK506血药浓度的方法国内主要有高效液相
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质谱联用(HPLC
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MS)、酶放大免疫测定(EMIA)、化学发光微粒子免疫测定(CMIA)、电化学发光免疫测定(ECLIA)等。其中HPLC
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MS法测定血药浓度准确、灵敏，但其操作繁琐，检测时间长，检测成本高，需要昂贵设备，主要用于科研领域或作为一种参考方法。国内市场基本被西门子EMIA、雅培CMIA、罗氏ECLIA三家瓜分，其3种都是检测自动化程度高，检测结果准确的方法学，但试剂价格昂贵，需要使用配套专用的仪器。
[0006]NTA
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Ni
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His标签
[0007]在1987年，Hochuli等人专利技术了改进的金属螯合配体次氮基三乙酸(N TA)，伴随着现代分子生物学和重组蛋白技术的高速发展，基于NTA配体在纯化组氨酸标签(his
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tagged)蛋白方面得到了很重要的应用。
[0008]众所周知，广泛使用的金属离子为Ni
2+
，其周围共有六个配位点供配体结合。IDA是
三齿配体，即可以结合Ni
2+
周围的三个配位点，剩余的三个配位点中两个用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基，另一个用于和H2O配位结合，因此，IDA对Ni
2+
的结合能力相对较弱，造成结合到介质上的Ni
2+
容易脱落，致使介质的性能不稳定。而NTA是四齿配体，即NTA可以结合Ni
2+
周围的四个配位点，剩余两个配位点用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基。
[0009]Fc受体蛋白
[0010]Fc受体指一系类细胞膜表面能与IgFc片段结合的受体。在免疫学中，具有Fc受体细胞一般有B细胞、杀伤细胞、巨噬细胞。抗体是由免疫细胞产生的特殊蛋白质，可以与抗原如微生物、毒素或过敏物质结合。当免疫细胞上的Fc受体与抗体及其附着的抗原结合时，可以引发吞噬作用，这样会消耗被抗体包被的抗原。
[0011]基于不同类型的抗体，会存在不同的特异性抗原。这也意味着也存在不同的Fc受体，每个Fc受体能够在其Fc区结合抗体。抗体也称为免疫球蛋白，简称Ig，并且最常见于血液中的IgG类型。Fc受体主要分为三类，包括Fc
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γ受体，Fc
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α受体和Fc
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ε受体。每种类型的Fc受体包含基于遗传同源性的几种亚型，比如Fc
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γ受体可结合IgG的Fc片段，Fc
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α受体可结合IgA的Fc片段，Fc
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ε受体可结合IgE的Fc片段。近年来研究发现一种小鼠Fc受体(Fcα/μR,又称FcAMR，CD351)，既可以结合IgM，又可以结合IgA。
[0012]胶乳增强免疫比浊法具有操作简单、快速、灵敏度高、可应用于自动生化分析仪，易于国产化等优点，但胶乳增强免疫比浊法大多用于大分子蛋白的测定，且相比较CMIA和ECLIA的方法学有灵敏度不足的缺点。因此，开发出一种可以更高灵敏度检测他克莫司小分子药物的新型胶乳增强免疫方法将为临床他克莫司作为免疫抑制剂的使用提供强有力的支持。
[0013]胶乳增强免疫竞争法是目前用于检测样本中药物小分子浓度的常用方法，该方法的原理是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，药物小分子(样本中的半抗原)和药物
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蛋白复合物(人工构建的抗原)两者同时竞争结合胶乳微球表面的抗体位点，反应体系的浊度大小与样本中的药物小分子浓度呈负相关，通过测定反应液的吸光度，计算样本中药物小分子的浓度。然而，传统的胶乳微球包被法，抗体位阻大，如图1所示。

技术实现思路

[0014]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中检测药物小分子他克莫司的方法较为复杂、灵敏度低、抗体位阻大等缺陷，从而提供了一种利用胶乳增强免疫竞争法低位阻高灵敏度定量测定全血中免疫抑制剂他克莫司的试剂盒。其具体原理如下：
[0015]在测定他克莫司浓度之前，对全血样本进行预处理，将全血中细胞内与蛋白结合的他克莫司提取出来。检测过程中，从样本中提取的他克莫司药物与药物蛋白复合物试剂(试剂R1)中的他克莫司药物
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蛋白复合物竞争结合致敏胶乳试剂(试剂R2)中胶乳微球表面的抗他克莫司抗体，样本中的他克莫司小分子药物竞争结合了抗体的位点，会抑制凝集反应。所以，当样本中他克莫司药物浓度较低时，产生凝集反应较强；当样本中他克莫司药物浓度较高时，产生的凝集反应较弱；反应体系产生的浊度大小与样本中的他克莫司浓度呈负相关，通过测定546nm附近的吸光度，计算全血样本他克莫司的浓度。
[0016]本专利技术的另一项创新点为，本专利技术使用的结合抗他克莫司单克隆抗体的纳米胶乳微球，能够定向结合抗体F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种定量测定他克莫司的试剂盒，包括致敏胶乳试剂，其特征在于，所述致敏胶乳试剂包含胶乳微球
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NTA
‑
Ni
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Fc受体
‑
抗他克莫司单克隆抗体。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述胶乳微球
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NTA
‑
Ni
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Fc受体
‑
抗他克莫司单克隆抗体的制备方法包含以下步骤：i)胶乳微球共价结合N
‑
(5
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氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸，制成胶乳微球
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NTA；ii)所述胶乳微球
‑
NTA结合Ni离子，制成胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni；iii)所述胶乳微球
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NTA
‑
Ni结合带His标签的Fc受体，制成胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体；iv)所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
‑
Fc受体结合抗他克莫司单克隆抗体的Fc端，制成所述胶乳微球
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NTA
‑
Ni
‑
Fc受体
‑
抗他克莫司单克隆抗体。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，i)中所述胶乳微球
‑
NTA的制备具体包含以下步骤：(1)将粒径50nm～350nm的所述胶乳微球分散在pH 5.8～6.5的MES中，使得微球质量体积百分比为1％，加入N
‑
羟基丁二酰亚胺和1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，使其包被浓度为0.1～3mg/10mg微球，于室温反应0.5
‑
3h；(2)离心弃去上清，用pH 5.8～6.5的MES重悬；(3)加入0.5～3mg/mL的N
‑
(5
‑
氨基
‑1‑
羧基戊基)亚氨基二乙酸，反应1
‑
3h；(4)加入30～50mmol伯胺，封闭反应1
‑
3h；(5)离心弃去上清，用pH 6.8～8.5的PBS重悬，制成所述胶乳微球
‑
NTA；优选地，N
‑
羟基丁二酰亚胺和1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的包被浓度为1.2mg/10mg微球。4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，ii)中所述胶乳微球
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NTA
‑
Ni的制备具体包含以下步骤：(1)加入Ni(CH3COO)2，反应0.5
‑
3h；(2)离心弃去上清，用pH 6.8～8.5的0.1Mol PBS重悬。5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，iii)中所述胶乳微球
‑
NTA
‑
Ni
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Fc受体的制备具体包含以下步骤：(1)将所述带His标签的Fc受体加入所述胶乳微球

【专利技术属性】
技术研发人员：林巍靖，宋晓婵，覃林娟，
申请(专利权)人：上海健耕医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：