一种快速筛选单克隆抗体的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种快速筛选单克隆抗体的方法及其应用，属于IVD诊断技术领域。该方法包括以下步骤：(1)用稀释液将相应抗原稀释后加入到酶标板进行包被；(2)加入洗涤液，摇床摇荡洗板，加入稀释液进行封闭；(3)加入洗涤液，摇床摇荡洗板；(4)以同一待测单克隆细胞上清作为待测样，取相同体积的待测样分别与PBS和临床样本混匀在恒温箱中反应；(5)将步骤(4)中的混合液分别加入包被好的96孔板中做对比，于恒温箱孵育；(6)加入洗涤液洗板；(7)加入酶标二抗孵育，洗板4～6次；(8)加入显色底物反应；(9)终止显色；(10)计算竞争抑制力，选择竞争抑制力不小于60％的待测样孔进行亚克隆。力不小于60％的待测样孔进行亚克隆。

【技术实现步骤摘要】
一种快速筛选单克隆抗体的方法及其应用


[0001]本专利技术属于IVD诊断
，尤其涉及一种快速筛选单克隆抗体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]杂交瘤单克隆抗体的筛选主要通过多次的亚克隆来获得单一B淋巴细胞产生的高度均一，仅能识别某一特定抗原表位的抗体，传统的筛选方法需要进行3～4次大批量酶标板的ELISA检测筛选及大批量样的送检筛选，过程繁琐，耗时耗人力，成本较高；亚克隆孔过多，增加细胞污染的风险，同时不能确定最后筛选得到的单克隆细胞株分泌的抗体是否能识别样本中的抗原。为此，急需一种单克隆抗体快速定位目标蛋白的筛选方法来解决这些问题。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的之一在于提供一种快速筛选单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：
[0004](1)用稀释液将相应抗原稀释成0.1～0.5μg/mL，按100μL/孔的量加入到聚苯乙烯酶标板进行包被；
[0005](2)加入200μL/孔洗涤液，摇床摇荡1～3min，转速100r/min，洗板4～6次，把未结合的抗原清洗干净，以150μL/孔的量加入含3～10％脱脂奶粉或3～10％BSA的稀释液进行封闭1小时；
[0006](3)加入200μL/孔洗涤液，分别摇床摇荡1～3min，转速100r/min，洗板4～6次后拍干；
[0007](4)同一个待测样(单克隆细胞上清)，取相同的体积分别与PBS和临床样本混匀，于37℃恒温箱中反应0.5小时；
[0008](5)分别取(4)的混合液，100μL/孔加入包被好的96孔板的2个孔中做对比，于37℃恒温箱孵育1～2.5小时；目的是筛选出可识别样本中抗原的待测样，即可在众多待测样中挑选出可识别样本中抗原的待测样进行下一步的亚克隆及其他实验，实现亚克隆孔的优化，减少亚克隆细胞数；另外100μL/孔的PBS加入新的2个酶标孔作为空白对照，用于判断包被的酶标板条的失效与否；
[0009](6)加入200μL/孔洗涤液，摇床摇荡1～3min，转速100r/min，洗板4～6次；
[0010](7)加入100μL/孔的1：1000～1：10000酶标二抗37℃孵育0.5～1小时，洗板4～6次，分别摇床摇荡1～3min；
[0011](8)加入显色底物TMB反应5～15min；
[0012](9)终止显色；
[0013](10)计算竞争抑制力，选择竞争抑制力不小于60％的待测样孔进行亚克隆及后续工作。
[0014]本专利技术的目的之二在于提供上述方法在快速筛选单克隆抗体中的应用。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0016](1)本专利技术洗板时采用摇床摇荡1～3min，能够最大限度的把未结合的临床样本给清洗干净，减少非特异吸附，降低假阳性的风险。
[0017](2)本专利技术先进行待测样与临床样本混合反应，目的是筛选出可识别样本中抗原的待测样，即可在众多待测样中挑选出可识别临床样本中抗原的待测样进行下一步的亚克隆及其他实验，实现亚克隆孔的优化，减少亚克隆细胞数。
[0018](3)本专利技术中，采用间接ELISA实验，通过待测样与PBS的混合孔和待测样与临床样本混合孔的OD
450
，按下式计算竞争抑制力，选择竞争抑制力不小于60％的待测样孔进行亚克隆及后续工作；
[0019][0020]其中A1：待测样与PBS混合孔的OD
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；
[0021]A2：待测样与临床样本混合孔的OD
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。
[0022](4)本专利技术实验操作简单，无需进行大批量亚克隆，降低成本，简单高效，避免大量亚克隆实验而导致细胞污染的风险。
[0023](5)本专利技术最终获得的单克隆细胞株分泌的抗体，可确定为能识别目标临床样本中的抗原。
具体实施方式
[0024]实施例1
[0025]一种快速筛选单克隆抗体的方法，步骤如下：
[0026]步骤一：使用CD45免疫抗原免疫小鼠达到融合条件后进行细胞融合；
[0027]步骤二：使用CD45包被抗原，200μL/孔加入到聚苯乙烯酶标板中，4℃包被过夜；用PBST洗板5次，每次洗板后都需摇床振荡2min，转速100r/min，加入3％BSA，150μL/孔，37℃封闭1小时，PBST洗板5次备用，每次洗板后都需摇床振荡2min，转速100r/min；
[0028]步骤三：同一个CD45待测细胞上清，取相同的体积分别与PBS和临床样本混匀于37℃恒温箱中反应0.5小时；
[0029]步骤四：分别取步骤三的混合液，100μL/孔加入包被好的96孔酶标板的2个孔中做对比，于37℃恒温箱孵育1～2.5小时；如PBS混合的孔与跟临床样本混合的孔的OD
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相差不低于一倍，说明CD45待测细胞上清能识别样本中的CD45抗原；
[0030]步骤五：加入200μL/孔洗涤液，摇床摇荡2min，转速100r/min，洗板5次；
[0031]步骤六：加入100μL/孔的1：1000酶标二抗37℃孵育0.5～1小时，洗板4～6次，分别摇床摇荡1～3min；
[0032]步骤七：加入显色底物TMB反应5～15min；
[0033]步骤八：终止显色；
[0034]步骤九：挑选步骤四确定的细胞孔进行竞争抑制力计算，挑选竞争抑制力相对较高(选择竞争抑制力不小于60％)的CD45细胞上清孔进行亚克隆；
[0035]步骤十：同样的方式(重复步骤二
‑
步骤九)进行目标蛋白单克隆抗体的筛选，进行到第二次亚克隆后即可确定所筛选出来的单克隆细胞株分泌得到的蛋白即为目的单克隆
抗体；筛选出的单克隆抗体细胞株扩大培养后打腹水制备单克隆抗体，即为平台所需的单克隆抗体。
[0036]对比例1
[0037]传统筛选单克隆抗体的方法，步骤如下：
[0038]步骤一：使用CD45免疫抗原免疫小鼠达到融合条件后进行细胞融合；
[0039]步骤二：使用CD45包被抗原，200μL/孔加入聚苯乙烯酶标板中，4℃包被过夜；用PBST洗板5次，加入3％BSA，150mL/孔，37℃封闭1小时，PBST洗板5次备用；
[0040]步骤三：分别取100μL细胞上清加入包被好抗原的酶标板中，通过ELISA方法挑选阳性值较高或抑制率较好的细胞孔，至少要经过3～4次亚克隆，所需筛选的96孔酶标板为30块以上才会获得阳性率较高的细胞株；
[0041]步骤四：经规模培养或小鼠腹水的腹水后纯化，获得单克隆抗体；
[0042]步骤五：此单克隆抗体应用到平台中会发现很有可能不能针对临床样本中的抗原，导致建株失败，只能从源头重新开始筛选，针对性较差。
[0043]以上所述的实施例仅是对本专利技术的优选方式进行描述，并非对本专利技术的范围进行限定，在不脱离本专利技术设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本专利技术的技术方案本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速筛选单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)用稀释液将相应抗原稀释成0.1～0.5μg/mL，并加入到酶标板进行包被；(2)加入洗涤液，摇床摇荡1～3min，洗板4～6次，把未结合的临床样本清洗干净，加入含3～10％脱脂奶粉或3～10％BSA的稀释液进行封闭；(3)加入洗涤液，摇床摇荡1～3min洗板4～6次后拍干；(4)以同一待测单克隆细胞上清作为待测样，取相同体积的待测样分别与PBS和临床样本混匀在37℃恒温箱中反应；(5)将步骤(4)中的混合液分别加入包被好的96孔板的2个孔中做对比，于37℃恒温箱孵育1～2.5小时；另外100μL/孔的PBS加入新的2个酶标孔作为空白对照；(6)加入洗涤液，摇床摇荡1～3min，洗板4～6次；(7)加入1：1000～1：10000酶标二抗37℃孵育0.5～1小时，洗板4～6次，分别摇床摇荡1～3min；(8)加入显色底物反应5～15min；(9)终止显色；(10)计算竞争抑制力，选择竞争抑制力不小于60％的待测样孔进行亚克隆及后续工作。2.根据权利要求1所述的快速筛选单克隆抗体的方法，其特征在于，所述所述临床样本为血清、全血...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢贞华，
申请(专利权)人：邢贞华，
类型：发明
国别省市：