一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用。本发明专利技术首先发现了非洲猪瘟病毒D1133L蛋白能够抑制IFN

【技术实现步骤摘要】
一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及IPTG诱导性敲除D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染引起的一种家猪和野猪烈性传染病，该病发病过程短，病死率接近100%，被世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。
[0003]非洲猪瘟病毒重组毒株以及相关疫苗的研制是应对非洲猪瘟的重要手段之一。
[0004]截止目前很多病毒的结构蛋白和一些非结构蛋白无法通过基因编辑技术直接敲除，导致无法明确该病毒蛋白在病毒复制过程中发挥的作用及装配机制。ASFV编码的D1133L基因属于非结构蛋白，与牛痘病毒的D6R具有相似的解旋酶基序，属于解旋酶，并且预测在病毒复制过程中发挥作用，D1133L属于晚期表达基因。
[0005]Lac操纵子中编码的酶在阻遏物——乳糖操纵子阻遏蛋白（lacrepressorlacI）负调控下，可以特异性的与乳糖操纵基因（lacoperatorLacO）结合并以高亲和力与其21bp序列结合，阻遏酶的表达。乳糖操纵子阻遏蛋白（lacrepressorlacI）也可以与异乳糖或异丙基硫代半乳糖苷（inducer isopropyl b
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D
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thiogalactoside,IPTG）结合，从而降低阻遏物对操纵子的亲和力，通过这种方式，IPTG可以减少Lac操纵子转录的抑制，从而诱导表达，该系统可以很好地调节哺乳动物细胞中转染和整合基因的表达，同时也在应用在病毒领域，比如在Vaccinia Virus（VACV）病毒中已使用该系统可以用来研究病毒形态发生（MENG X, EMBRY A, ROSE L, et al. Vaccinia virus A6 is essential for virion membrane biogenesis and localization of virion membrane proteins to sites of virion assembly [J]. J Virol, 2012, 86(10): 5603
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5613.），成为转录调控病毒蛋白与宿主互作的有力工具。

技术实现思路

[0006]本专利技术首先发现了非洲猪瘟病毒D1133L蛋白能够抑制IFN
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β及下游细胞因子ISG
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15、ISG
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56的mRNA表达，具有免疫抑制作用。其次，为了降低非洲猪瘟病毒的免疫抑制活性，本专利技术利用IPTG诱导表达系统构建了敲除D1133L基因的ASFV重组病毒。
[0007]具体的，本专利技术提供了非洲猪瘟病毒D1133L蛋白在制备抑制IFN
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β及下游抗病毒细胞因子ISG15、SG56表达的药物中的应用。
[0008]本专利技术还提供了一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，该非洲猪瘟病毒减毒株是将D1133L基因下游序列和D117L上游序列分别约1.0 kb分别克隆入pUC118中作为左右同源臂，然后在左右同源臂之间插入p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO筛
选表达盒，得到同源重组转移载体；接着将同源重组转移载体与野生毒ASFV进行同源重组，使p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO筛选表达盒插入到ASFV的非结构蛋白基因D1133L之前得到重组病毒ASFV vD1133Li，所得到的重组病毒含有lacI和lacO序列。
[0009]重组病毒ASFV vD1133Li中，Lac I为调节基因，可调节操纵基因的活动，调节基因能转录出mRNA，并合成一种蛋白，称阻遏蛋白，在异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）缺少的情况下，阻遏蛋白因其构象能够识别操纵基因并结合到操纵基因上，因此RNA聚合酶就不能与启动基因结合，结构基因也被抑制，结果结构基因不能转录出mRNA，不能翻译D1133L蛋白，在IPTG存在的情况下，乳糖代谢产生别乳糖，别乳糖能和调节基因产生的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白改变构象，不能在和操纵基因结合，失去阻遏作用，结果RNA聚合酶便与启动基因结合，并使结构基因活化，转录出mRNA，翻译出D1133L蛋白。lac O为控制基因转录速度，不合成mRNA。
[0010]在存在IPTG的情况下，所得到的重组病毒与野生型具有相似特征，无IPTG存在时，D1133L蛋白的表达会被抑制。
[0011]上述的IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株是利用ASFV CN/GS 2018分离株构建的重组病毒。
[0012]上述重组病毒的制备具体包括以下步骤：（1）eGFP筛选表达盒构建：以peGFP
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N1载体（peGFP
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N1载体购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司）为模板，扩增eGFP基因，备用；以ASFV CN/GS 2018为模板，通过PCR扩增p72启动子(从p72基因上游的
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196nt到+17之前序列)，备用；将上述步骤扩增获得的p72启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接。合成利用U104L启动子启动的LacI，以及由p72启动合成的LacO，将p72启动子
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eGFP、U104L
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LacI、p72
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LacO连接，命名为p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO。
[0013]（2）同源重组转移载体的构建：设计将D1133L基因的下游序列和D117L上游序列约1.0kb作为左同源重组臂和右同源臂，分别克隆入骨架载体pUC118载体中，然后在左右两个同源臂之间插入p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO筛选表达盒，经测序正确后得到同源重组转移载体命名为pUC
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p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO；用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定浓度，
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20℃保存备用。构建策略见图4。
[0014]完整的D1133L基因序列为非洲猪瘟病毒ASFVCN/GS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非洲猪瘟病毒D1133L蛋白在制备抑制IFN
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β及下游抗病毒细胞因子ISG15、SG56表达的药物中的应用。2.一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，其特征在于，利用大肠杆菌lac操纵基因
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阻遏物系统，通过IPTG诱导性缺失非洲猪瘟病毒的D1133L基因得到非洲猪瘟病毒减毒株；无IPTG存在时，所得到的非洲猪瘟病毒减毒株的D1133L蛋白的表达被抑制。3.根据权利要求2所述的一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS 2018，所述D1133L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。4.权利要求2所述的一种IPTG诱导性缺失D1133L基因的非洲猪瘟病毒减毒株制备方法，其特征在于，将D1133L基因的下游序列和D117L上游序列克隆入pUC118中分别作为左右同源臂，然后在左右同源臂之间插入p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO筛选表达盒，得到同源重组转移载体；接着将同源重组转移载体与野生非洲猪瘟病毒进行同源重组，使p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO筛选表达盒插入到野生非洲猪瘟病毒的D1133L之前得到重组病毒ASFV vD1133Li。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS 2018。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）eGFP筛选表达盒构建：扩增eGFP基因和p72启动子；合成利用U104L启动子启动的LacI，以及由p72启动合成的LacO，将p72启动子、eGFP、U104L
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LacI、p72
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LacO连接，得到筛选表达盒，命名为p72
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eGFP
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U104L
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LacI
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p72
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LacO；（2）同源重组转移载体的构建：设计将D1133L基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，张克山，张婷，冯涛，杨博，杨行，史喜绢，田宏，茹毅，杨帆，朱紫祥，郭建宏，何继军，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：