一种驴肉中脂质组成的分析方法技术

本发明专利技术提供一种驴肉中脂质组成的分析方法，对驴肉样品进行总脂提取，对脂质分子进行分离、鉴定和分析。本发明专利技术通过氯仿

【技术实现步骤摘要】
一种驴肉中脂质组成的分析方法


[0001]本专利技术属于驴肉组成检测分析领域，具体涉及一种驴肉中脂质组成的分析方法。

技术介绍

[0002]驴是重要的经济家畜，为人类提供皮、奶和肉类。驴肉因其独特的风味特征、低热量、高蛋白质和富含多种不饱和脂肪酸等特点，已成为绿色、健康优质肉类的代表，深受广大消费者喜爱，具有较高的开发和利用价值。驴产业是我国特色产业，对于优化畜牧业结构、丰富畜产品种类具有重要作用。
[0003]肌内脂肪是影响肉品质（“雪花肉”）的重要因素，与肉的风味、多汁性和嫩度直接相关，而风味是决定驴肉品质的重要因子。驴肉加工过程中富含的多不饱和脂肪酸氧化降解形成的挥发性风味物质是构成驴肉风味特征的重要成分。驴肉中肌内脂肪含量和脂肪酸组成已清晰，且肌内脂肪与驴肉品质密切相关。但驴肉中脂质特质性成分不明，品质评价技术匮乏，亟待开发一种扫描速度快、分辨率高、分析通量高、高特异和灵敏性的脂质组成分析方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种驴肉中脂质组成的分析方法，可对驴肉进行脂质组学分析，对驴肉进行总脂提取，对脂质分子进行快速分离、鉴定和分析。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种驴肉中脂质组成的分析方法，包括以下步骤：（1）样品脂质提取：取一定量驴肉样品加入氯仿
‑
甲醇混合溶液（2:1，V/V）中进行高通量组织研磨；然后将研磨后的样品进行冰上提取，提取的同时进行涡旋振荡；提取后进行离心，并将所得上清液浓缩（真空）至干，然后溶解于适量异丙醇中，用滤膜（0.22 μm）过滤后冷冻储藏（
‑
20 ℃）。
[0006]优选的，所述驴肉样品与氯仿
‑
甲醇混合溶液用量的质量体积比为2mg:15 μL；所述高通量组织研磨为在高通量组织研磨仪中于60 Hz研磨120秒；所述冰上提取进行2 h，同时每30 min涡旋振荡30 s；所述离心为：在4℃条件下以10000
×
g离心15 min。
[0007]（2）样品测试：采用高效液相色谱
‑
质谱串联对步骤（1）得到的冷冻储藏样品进行分析；液相色谱条件为：C18色谱柱（2.1 mm
×
100 mm，1.7
ꢀµ
m）；自动进样器温度8 ℃；柱温55 ℃；流动相A：乙腈
‑
水（40:60，V/V，含10 mmol/L甲酸铵）；流动相B：异丙醇
‑
乙腈（90:10，V/V，含10 mmol/L甲酸铵）；流速0.30 mL/min；
梯度洗脱程序：0～1.5 min，60% A、40% B；1.5～10.5 min，60%～15% A、40%～85% B；10.5～14 min，15% A、85% B；14～14.1 min，15%～0% A、85%～100% B；14.1～15 min，0% A、100% B；15～15.2 min，0%～60% A、100%～40% B；15.2～18 min，60% A、40% B。
[0008]质谱条件为：电喷雾离子源；正模式进样体积2 μL，负模式进样体积6 μL；离子源雾化气压力50 psi；辅助气压力50 psi，气帘气压力30 psi，离子源温度600 ℃，正、负模式电压分别为5000 V和
‑
4500 V；去簇电位100 V；每个采集周期包括一个快速飞行时间质谱（Time of flight mass spectrometry，TOF MS）扫描（200 ms），然后连续采集11 个子离子扫描（每个50 ms）；TOF MS扫描质量范围为200～2000 Da，碰撞能量10 eV；子离子扫描范围100～2000 Da，碰撞能量（45
±
25）eV。
[0009]（3）数据分析：利用脂质结构数据库（LMSD，http://www.lipidmaps.org/）对步骤（2）所得原始脂质数据进行注释；利用Xcalibur软件对注释脂质进行归一化处理；再利用GraphPad Prism 8对数据分析，分析脂质组成（脂质类型和比例）；然后利用Metabo Analyst软件对数据进行主成分和正交偏最小二乘判别分析；利用SAS软件进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验分析，依据第一主成分投影中具有可变重要性（Variable Importance in projection，VIP）>1和P<0.05，筛选差异脂质；采用接收者操作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线筛选潜在脂质标志物；通过在线KEGG路径数据库（https://www.kegg.jp/kegg/），将差异脂质进行功能富集。
[0010]本专利技术具有以下积极有益效果：本专利技术采用氯仿
‑
甲醇溶液和高通量组织研磨实现快速提取驴肉中脂质，然后采用高效液相色谱
‑
质谱串联对驴肉进行脂质组学分析，采用脂质结构数据库（LMSD，http://www.lipidmaps.org/）、Xcalibur和GraphPad Prism 8软件对原始脂质数据进行注释、归一化处理、多元统计分析、差异脂质筛选和富集，该方法能丰富充实驴肉中脂质分子基础，为驴肉的鉴定提供脂质标记物，为驴肉脂质成分分析、产地溯源和品种选育提供技术支持。
附图说明
[0011]图1为德州三粉驴和乌头驴背最长肌样品中脂质组成的正离子流图；图2为德州三粉驴和乌头驴背最长肌样品中脂质组成的负离子流图；图3为德州三粉驴和乌头驴背最长肌脂质组成；图4为德州三驴粉和乌头驴背最长肌的脂质组学数据的OPLS
‑
DA评估（A）和置换检验图（B）；
图5为德州三粉驴和乌头驴背最长肌差异脂质分子和潜在脂质标记物，A.脂质分子热图分析；B.潜在脂质标志物的ROC曲线；C.磷脂酰胆碱（PC）脂质标记物的峰面积；D.甘油三酯（TG）脂质标记物的峰面积；E.甘油二酯（DG）脂质标记物的峰面积；图6为德州三粉驴和乌头驴背最长肌差异脂质分子功能富集，A.差异脂质分子KEGG途径富集；B.脂质相关的重要代谢途径。
具体实施方式
[0012]下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步的描述，但本专利技术的实施例不限于此。
[0013]一种驴肉中脂质组成的分析方法，依次包括以下步骤：（1）样品脂质提取：取100 mg德州三粉驴（Sanfen，SF）和乌头驴（Wutou，WT）的背最长肌样品分别置于2 mL匀浆管中，加入750 μL氯仿
‑
甲醇混合溶液（2:1，V/V）和1 颗3 mm钢珠，放入高通量组织研磨仪中60 Hz研磨120 s；然后将样品在冰上提取2 h，每30 min涡旋振荡30 s；再在4 ℃、10000
×
g离心15 min，所得上清液在真空浓缩至干；然后溶解于200 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种驴肉中脂质组成的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样品脂质提取：取一定量驴肉样品加入氯仿
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甲醇混合溶液中进行高通量组织研磨；然后将研磨后的样品进行冰上提取，提取的同时进行涡旋振荡；提取后进行离心，并将所得上清液浓缩至干，然后溶解于适量异丙醇中，用滤膜过滤后冷冻储藏；（2）样品测试：采用高效液相色谱
‑
质谱串联对步骤（1）得到的冷冻储藏样品进行分析；（3）数据分析：利用脂质结构数据库对步骤（2）所得原始脂质数据进行注释；利用Xcalibur软件对注释脂质进行归一化处理；再利用GraphPad Prism 8对数据分析，分析脂质组成。2.根据权利要求1所述驴肉中脂质组成的分析方法，其特征在于：步骤（1）所述氯仿
‑
甲醇混合溶液中氯仿和甲醇的体积比为2:1。3.根据权利要求1所述驴肉中脂质组成的分析方法，其特征在于：步骤（1）所述滤膜的孔径为0.22 μm。4.根据权利要求1所述驴肉中脂质组成的分析方法，其特征在于：步骤（1）所述驴肉样品与氯仿
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甲醇混合溶液用量的质量体积比为2mg:15μL。5.根据权利要求1所述驴肉中脂质组成的分析方法，其特征在于：步骤（1）所述高通量组织研磨为在高通量组织研磨仪中于60 Hz研磨120秒；所述冰上提取进行2 h，同时每30 min涡旋振荡30 s；所述离心为：在4℃条件下以10000
×
g离心15 min。6.根据权利要求1所述驴肉中脂质组成的分析方法，其特征在于：步骤（2）中液相色谱的条件为：C18色谱柱，2.1 mm
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100 mm，1.7
ꢀµ
m；自动进样器温度8 ℃；柱温55 ℃；流动相A：乙腈
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水，体积比40:60，含10 mmol/L甲酸铵；流动相B：异丙醇
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乙腈，体积比90:10，含10 mmol/L甲酸铵；流速0.30 mL/min；梯度洗脱程序：0～1.5 min，60% A、40% B；1.5～10.5 min，60%～15%...

【专利技术属性】
技术研发人员：李孟孟，王长法，任薇，朱明霞，柴文琼，刘桂芹，刘文强，
申请(专利权)人：聊城大学，
类型：发明
国别省市：