本发明专利技术公开了一种用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒及其应用，通过培养获得烟草黑胫病菌丝和孢子，将菌丝和孢子免疫小鼠，并通过筛选得到特异性的单克隆抗体，最终开发出定量检测烟草黑胫病菌含量的酶联免疫定量检测试剂盒。其包括：通过培养获得烟草黑胫病菌菌丝和孢子；用菌丝和孢子免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体；用HRP偶联抗体，用双抗体夹心的ELISA方法，筛选配对抗体，可定量检测烟草黑胫病菌；生产试剂盒，对实际样本进行检测。对烟草中的烟草黑胫病菌进行定性定量检测，具有特异性强、灵敏度高、简单快速等优点。简单快速等优点。简单快速等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及农业生物
，涉及一种烟草黑胫病菌的酶联免疫定量检测试剂盒的制备及其应用。
技术介绍
[0002]烟草黑胫病(Phophhro nicotinae Breda de Hann)于1896年首次发现于印尼爪哇，现已是世界性烟草的毁灭性病害之一，从苗期到成株期都可发生。烟草黑胫病又被称为黑秆疯、乌头病等，是由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)引起的较为严重的土传真菌性病害，由于烟草黑胫病分布广泛、田间潜伏时间长等原因，烟株经过病菌的侵害后会出现叶片枯萎变黄、叶片腐烂、茎秆褐变甚至植株死亡等现象，并且烟草在整个生育期都可能受到疫霉的危害，对烟叶产量和内在品质造成了严重影响，并且造成极大的经济损失，是烟叶毁灭性病害之一。
[0003]检测烟草黑胫病菌传统的方法主要是以病原菌形态及生理生化特征进行检测。随着分子生物学的发展，以PCR为基础的分子生物学鉴定被广泛应用。但不论是传统的方法还是分子生物学鉴定都对操作人员的专业素养要求较高，无法广泛普及，无法对烟草黑胫病菌进行现场快速检测。
[0004]酶联免疫检测技术(elisa试剂盒检测方法)是20世纪60年代末期发展起来的一种免疫学检测方法，是目前最广泛应用的标记免疫技术。1966年Nakene和Pierce共同发表了《酶标抗体：制备和抗原定位中的应用》，首先提出了酶联免疫技术(ELISA试剂盒检测方法)的基本原理。1971年Engvall和Perlmann发表《ELISA KIT方法吸附试验测定IgG含量》一文，使酶联免疫(ELISA试剂盒检测)技术成为一种实用的检测液体标本中微量物质的方法。目前酶联免疫(ELISA试剂盒)检测技术已广泛用于免疫学、微生物学、寄生虫学等。由于其具有灵敏度高、试剂稳定、设备简单、操作安全等优点，近几年也将其应用到食品领域中来检测某些食品中的生理活性物质。
技术实现思路
[0005]为了对烟草黑胫病菌进行快速筛选检测，本专利技术提供一种烟草黑胫病菌的酶联免疫定量检测试剂盒的制备及其应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]方案一：将烟草黑胫病菌经过培养得到烟草黑胫病菌菌丝和孢子；用该菌丝孢子诱导免疫新西兰大白兔，通过获取兔血清，并经过纯化，得到兔多克隆抗体；用该菌丝孢子诱导免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，再用免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，通过筛选获得特异性单克隆抗体细胞株，通过制备腹水的方式，经过纯化获得特异性单克隆抗体；用双抗体夹心的ELISA方法，筛选配对抗体；通过优化得到ELISA试剂盒体系，建立双抗体夹心的ELISA方法；生产试剂盒，对实际样本进行检测。
[0008]方案二：本专利技术提供一种检测烟草黑胫病菌的试剂盒，所述试剂盒包含第一方面
所述的单克隆抗体和多克隆抗体。
[0009]优选地，所述试剂盒包括如下组分：
[0010](1)方案一所述的单克隆抗体预包被酶标板
[0011](2)样品稀释液，其为磷酸盐缓冲液；
[0012](3)洗涤液，其为含Tween
‑
20的磷酸盐缓冲液；
[0013](4)反应终止液，其为H2SO4溶液；
[0014](5)酶标抗体，为辣根过氧化物酶(HRP)标记的第一方面所述的多克隆抗体；
[0015](6)显色剂为TMB显色剂；
[0016](7)烟草黑胫病菌标准品。
[0017]包被抗体和酶标抗体分别为方案一所述的单克隆抗体合多克隆抗体，组分(1)中，所述抗体预包被酶标板的制备过程如下：
[0018](1)将抗体稀释到一定浓度，加至96孔酶标板，每孔100ul，37℃反应3h；
[0019](2)将板孔溶液甩干，加入洗涤液，浸泡5min，将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干；
[0020](3)将封闭液加至96孔酶标板，每孔150ul，37℃反应2h；
[0021](4)将板孔溶液甩干，在吸水纸上拍干，用冷冻干燥机抽干；
[0022](5)用真空包装机包装于铝箔袋中。
[0023]所述抗体预包被酶标板的制备过程中，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液；进一步优选地，所述碳酸盐缓冲液为Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液，其浓度为0.1M，pH值为9.6。
[0024]所述抗体为方案二所述的单克隆抗体对的第一单克隆抗体或第二单克隆抗体。
[0025]所述抗体的包被浓度为1.8～2.2μg/ml、优选1.9～2.1μg/ml、更优选2μg/ml。
[0026]所述封闭液为含BSA的碳酸盐缓冲液。
[0027]组分(5)中，所述酶标抗体为第二所述的单克隆抗体对的第二单克隆抗体或第一单克隆抗体，且被HRP标记；
[0028]所述酶标抗体的浓度为8～12μg/ml、优选9～11μg/ml、更优选10μg/ml；
[0029]加入抗体后的孵育温度为22～26℃、优选25℃，孵育时间为40～50分钟、优选45分钟。
[0030]组分(7)中所述烟草黑胫病菌标准品为将烟草黑胫病菌经过培养获得的菌丝。
[0031]组分(4)中所述硫酸为1.8～2.2M、优选1.9～2.1M、更优选2M的硫酸。
[0032]方案三：本专利技术提供一种检测烟草黑胫病菌的方法，采用方案二所述的试剂盒，包括如下步骤：
[0033](1)从待检样本中提取蛋白，得蛋白提取液；
[0034](2)用第四方面所述试剂盒对蛋白提取液进行检测，其主要过程包括加样、孵育、洗涤、加酶、孵育、洗涤、显色、终止和读数。
[0035](3)通过用烟草黑胫病菌标准品制作的浓度
‑
吸光度标准曲线，计算待检样品中的烟草黑胫病菌浓度。
[0036]本专利技术的有益效果：本专利技术提供的抗体对特异性强、灵敏度高，效价高，可特异性对烟草中的烟草黑胫病菌进行精准定量检测，鉴定结果准确、可靠，灵敏度高，为烟草作物培养和推广应用奠定了基础，检测方法简单快速，为大规模育种后代选择的现场检测提供了有力保障。并且本专利技术的抗体也可应用于WB、ELISA、IP等实验。
附图说明
[0037]图1是使用本专利技术方法检测烟草黑胫病菌的标准曲线。
具体实施方式
[0038]下文以示例性地方式对本专利技术进行更详细地描述。
[0039]本专利技术实施例涉及的试剂、抗体、质粒、仪器如下表1：
[0040]表1主要试剂、抗体、质粒及仪器
[0041][0042][0043]实施例1、烟草黑胫病菌的培养
[0044](1)病菌的分离与获取
[0045]分别从宜宾市兴文县、筠连县、珙县烟田采集发病植株，累计采集83株病株，利用组织分离法成功分离到70株烟草黑胫病菌，经形态特征和分子鉴定为烟草疫霉(Phytophtora nicotianae)。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述的预包被酶标板是抗烟草黑胫病菌的单克隆抗体包被的酶标板，所述的酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的抗烟草黑胫病菌的多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的单克隆抗体的制备方法如下：用烟草黑胫病菌菌丝孢子免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、克隆化筛选制备得到单克隆抗体杂交瘤细胞株，再通过制取腹水，将腹水纯化获得。3.根据权利要求1所述的用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的多克隆抗体的制备方法如下：通过将烟草黑胫病菌培养获得菌丝和孢子，用菌丝和孢子免疫兔子，获取兔子血清后纯化获得。4.根据权利要求1所述的用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的抗烟草黑胫病菌的单克隆抗体包被的浓度为2μg/mL，所述的酶标记抗体的浓度为1μg/mL。5.根据权利要求1所述的用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括标准品冻干粉、样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液。6.根据权利要求5所述的用于检测烟草黑胫病菌的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的标...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘月敏，杨懿德，周本国，羊国根，杨洋，许大凤，鄢敏，王文凤，李林秋，王芳，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院烟草研究所四川省烟草公司宜宾市公司，
类型：发明
国别省市：
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