本发明专利技术提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法，属于动物分子遗传学领域。试剂盒利用1对线粒体COI序列特异性引物对鱼类样本进行PCR扩增反应，反应后发现PCR扩增条带在圆口铜鱼和铜鱼之间存在具有较大差异，通过凝胶电泳显示可以直接鉴定出圆口铜鱼和铜鱼。本发明专利技术在鲤科铜鱼属的两种鱼类中设计1对引物进行PCR扩增、凝胶电泳显示直接进行分析鉴定，具有实验准确，鉴定可靠快捷，操作简便等优点。利用本方法可以快速鉴别圆口铜鱼和铜鱼两个物种，对圆口铜鱼规模化放流的种质鉴定提供了技术支撑。鉴定提供了技术支撑。
【技术实现步骤摘要】
一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法
[0001]本专利技术涉及一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法，属于动物分子遗传学领域。
技术介绍
[0002]圆口铜鱼(Coreiμs guichenoti)隶属鲤形目(Cypriniformes)、鮈亚科(Gobioninae)、铜鱼属(Coreius)，主要分布在长江上游水域，是当地重要的经济鱼类和主要捕捞对象，也是长江上游珍稀特有鱼类保护区的指标性物种。近年来，随着长江上游水电站的大力开发和过度捕捞对生态环境的影响，圆口铜鱼产卵场遭到破坏、洄游通道被阻断，其种群资源量急剧下降，物种生存面临巨大威胁，2016年被列入极危(CR)等级。因此，加强圆口铜鱼种群资源保护和恢复工作已极为迫切。目前，增殖放流被认为是圆口铜鱼资源保护和生态修复的主要途径之一。
[0003]为了保证放流的生态安全性，必须严格控制放流种类和来源。放流苗种原则上要以本地原种和子一代苗种为主，不得向天然水域中投放杂交种、转基因种及种质不纯等不符合生态安全要求的物种。为保证放流圆口铜鱼的种质纯正性和遗传质量，有必要对放流苗种进行鉴定。鲤科铜鱼属共三种鱼类，分别为圆口铜鱼(Coreius guichenoti)、铜鱼(Coreius heterodon)和北方铜鱼(Coreius septentrionalis),其中北方铜鱼为黄河流域特有鱼类，仅分布于黄河水系，故长江流域圆口铜鱼放流主要干扰种类为铜鱼，圆口铜鱼和铜鱼在早期发育阶段形态特征相似，仅从形态上难以进行鉴别，因此需要一种从基因组的特异性出发的快速鉴定方法。
[0004]细胞色素C氧化酶亚基I(COI)位于线粒体基因组上，是线粒体基因组的13个编码蛋白质的基因中分子量最大，功能结构域最为保守的基因。同时COI基因由于其氨基酸的演化速率较慢可以区分分异时间较远的种类，同属物种的COI基因序列又存在有足够的变异，能够区分亲缘关系很近的种类，所以COI基因被广泛用于不同分类阶元层次上的分子系统学研究。不仅如此，COI基因在保证足够变异的同时很容易被通用引物扩增，能够获得绝大多数动物的5
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端序列，其序列又很少有插入或缺失发生，因而COI基因被选为DNA分类的标记基因；同时在利用PCR技术进行物种鉴定中应用前景十分广阔。因此COI基因可以用来鉴定圆口铜鱼和铜鱼。
技术实现思路
[0005]鉴于上述问题，本专利技术提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，试剂盒及鉴定方法，该引物对、试剂盒及鉴定方法可以快速从分子层面鉴定圆口铜鱼和铜鱼，且方法简单易操作，准确度高。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，该COI引物对由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成。
[0008]本专利技术还提供了该COI引物对在制备鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒中的应用。
[0009]本专利技术还提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒，包括上述的COI引物对，Taq DNA聚合酶，10
×
PCR Buffer，dNTP，MgCl2，ddH2O。
[0010]本专利技术还提供了一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法，包括如下步骤：
[0011](1)提取待测样品的基因组DNA；
[0012](2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的试剂盒对DNA模板进行扩增。
[0013](3)根据步骤(2)中的扩增结果进行判定：若扩增出两个条带，则DNA模板来源于圆口铜鱼；若扩增出一个明亮条带，则DNA模板来源于铜鱼。
[0014]优选地，扩增体系如下：
[0015][0016]优选地，DNA模板的浓度为100
‑
500ng/μL。
[0017]优选地，前引物或后引物在扩增体系中的浓度为100
‑
1000pmol/μL。
[0018]优选地，扩增程序为：93
‑
95℃预变性3
‑
5min；93
‑
95℃变性25
‑
35s，55
‑
60℃退火30
‑
50s，72℃延伸30
‑
60s，30
‑
40个循环；72℃延伸5
‑
10min；4℃保存。
[0019]优选地，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火温度58℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
[0020]有益效果
[0021]1.以线粒体COI基因为模板进行引物的设计，可以鉴定亲缘关系很近的圆口铜鱼和铜鱼，且准确率达到了100％。
[0022]2.本专利技术的试剂盒可以快速简单的完成鉴定工作，不需要测序即可简单的鉴定圆口铜鱼和铜鱼，具有快速使用、操作简单等优点；适用于放流等种质鉴定和与渔政执法以及非法贸易等市场监管。
附图说明
[0023]图1为圆口铜鱼和铜鱼线粒体COI序列比对图。
[0024]图2为线粒体COI的6对引物在圆口铜鱼和铜鱼DNA中的扩增片段的凝胶电泳图。其中M：DL1000 Marker；NC：阴性对照，编号1
‑
6为圆口铜鱼样本，编号7
‑
12为铜鱼样本。
[0025]图3为引物Cg1
‑
F，Cg1
‑
R在圆口铜鱼和铜鱼中的扩增片段的凝胶电泳图。其中编号1
‑
10为圆口铜鱼样本，编号11
‑
20为铜鱼样本，其余标注同图2。
[0026]图4为引物Cg1
‑
F，Cg1
‑
R在圆口铜鱼和铜鱼随机混合样本中的扩增片段的凝胶电泳图。其中编号1
‑
16为随机的圆口铜鱼和铜鱼样本，其余标注同图2。
[0027]具体实施例方式
[0028]下面结合附图与实施例对本专利技术进行详细阐述，所举实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术。
[0029]实施例1 DNA样本提取
[0030]圆口铜鱼和铜鱼的基因组DNA的提取采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA提取试剂盒(DP304)，具体操作步骤如下：
[0031](1)分别取圆口铜鱼和铜鱼鳍条组织0.5g，置于碾钵中，，放入2mL的灭菌离心管中，加入1
×
TE无菌缓冲液，4℃浸泡12h；
[0032](2)取出鳍条组织，放入含有352μL的无菌抽提缓冲液中，轻轻混匀，加入40μL 20％SDS和10μL 20mg/mL蛋白酶K(终浓度为400μg/mL)，混匀；
[0033](3)56℃孵育4h，每隔半小时轻轻摇晃离心管以利于消化。若组织不易消化，可延长孵育时间至8h，或37℃消化过夜；本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的COI引物对，其特征在于：所述COI引物对由SEQIDNO:1所示的上游引物和SEQIDNO:2所示的下游引物组成。2.根据权利要求1所述的COI引物对在制备鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒中的应用。3.一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的COI引物对，TaqDNA聚合酶，10
×
PCRBuffer，dNTP，MgCl2，ddH2O。4.一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）提取样品的基因组DNA；（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，采用权利要求3所述的试剂盒对DNA模板进行扩增；（3）根据步骤（2）中的扩增结果进行判定：若扩增出两个条带，则DNA模板来源于圆口铜鱼；若扩增出一个明亮条带，则DNA模板来源于铜鱼。5.根据权利要求4所述的一种鉴定圆口铜鱼和铜鱼的方法，其特征在于：所述扩增体系如下：10
×
PCRBuffer2.5μLdNTP（2.5mmol/L）0.5μLMgCl21.5μLTaqDNA聚合酶0.5μL前引物0.1
‑
1.0μL后引物0.1
‑
1.0μLDNA模板0.5
‑
【专利技术属性】
技术研发人员：肖衎，杜合军，杨菁，曲焕韬，黄红涛，舒婷婷，
申请(专利权)人：中国长江三峡集团有限公司中华鲟研究所，
类型：发明
国别省市：
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