非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白及其制备方法和用途。所述的p30抗原表位蛋白选自p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、p30f、p30g、p30I抗原表位蛋白中的任意一种或是由p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、p30f、p30g、p30I抗原表位蛋白中任意两种以上串联后得到的重组多表位蛋白。本发明专利技术以我国分离的ASFVpig/HLJ/2018毒株的主要结构蛋白p30为对象，利用生物信息学技术结合免疫学方法，预测、筛选ASFV的抗原表位，绘制这些蛋白的抗原表位图谱，最终确定了8个抗原表位(肽)为非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原表位。这些候选抗原表位的获得，极大了节省了传统抗原表位筛选的成本和时间，提高了免疫学方法验证具有良好免疫保护功能的抗原表位的效率，对研发ASF新型疫苗和检测技术具有十分重要的意义。具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及一种抗原表位蛋白及其制备方法和用途，特别涉及一种非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白及其制备方法和用途。本专利技术属于生物医药


技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染猪引起的一种急性烈性传染病，死亡率高达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报动物疫病，我国列为重点防范的一类动物传染病。
[0003]非洲猪瘟病毒作为一个有百年历史的重要动物病毒，对疫苗的研究从未间断，但至今仍然缺乏可用于防控实践安全、有效、可鉴别诊断的疫苗。
[0004]针对非洲猪瘟病毒及其复杂，保护性抗原/抗原表位谱不详，已成为制约基因工程疫苗研究的关键科学问题，本专利技术开展了非洲猪瘟病毒保护性抗原/抗原表位发掘研究，以解决非洲猪瘟病毒保护性抗原/抗原表位图谱不详，制约基因工程疫苗研究缺乏关键材料的困境，以期为研发非洲猪瘟基因工程疫苗提供物质基础和技术支撑。
[0005]本专利技术以非洲猪瘟病毒膜蛋白之一的p30(CP204L)的一级结构氨基酸序列为材料，通过抗原表位数据库，分析、预测其抗原表位，根据氨基酸序列合成与之相对应的肽。利用非洲猪瘟病毒感染猪阳性血清筛选能与其发生特异性免疫反应，而不与猪瘟阳性血清发生免疫反应的特异性肽(抗原表位)，最终确定8个抗原表位(肽)为非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原表位。这些抗原表位的获得为以抗原表位为材料研发非洲猪瘟检测试剂及其试剂盒、单抗制备和安全、可鉴别诊断表位疫苗等急需战略防控产品奠定了基础。不仅将产生巨大的经济效益，而且具有重要的社会效益。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白及其制备方法和用途。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0008]本专利技术利用TMHMM软件对ASFVp30蛋白的跨膜区域进行预测，该软件是一种基于隐马尔可夫数学模型建立的用于预测蛋白质的跨膜区域，准确率高达 97％～98％(Krogh et al,2001)。结果显示，在p30蛋白无跨膜区域。然后，利用 IEDBAnalysis Resource和ABCpred软件对ASFVp30蛋白的B细胞线性表位进行预测，阈值设为不低于0.5的为候选抗原表位。IEDBAnalysis Resource是通过神经网络(ANN)和支持向量机(SMM)建模预测抗原表位，其中有关免疫表位均选自在PubMed可获得的科学出版物数据，对多肽的亲水性、柔韧性、易接近性、转角、暴露表面、极性和抗原倾向等参数进行分析(Jespersen et al,2017)，在ASFV p30蛋白蛋白上确定了7个抗原表位。ABCpred是基于人工神经网络 (ANN)的模型，通过对Bcipep数据库的表位数据训练建立的预测B细胞抗原表位数据库软件(Saha etal,2007)，在ASFVp30蛋白上确定了21个抗原表位。接着，本专利技术通过建立间接ELISA方法，根据
抗原表位(合成肽)与ASFV感染阳性血清发生免疫反应结果，确定具有免疫活性的抗原表位。根据ELISA结果，从 p30蛋白的预测的抗原表位中，共筛选得到8个有免疫活性的p30蛋白抗原表位。值得一提的是，通过生物信息学技术结合免疫学方法发现了一个ASFVp30蛋白的新抗原表位p30b(30
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35)。为了克服抗原表位小分子特性及免疫反应弱的缺点，提高抗原表位筛选的准确性，本专利技术利用基因操作技术，将抗原表位DNA序列插入携带GST标签的原核表达载体pGEX
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1，构建重组表达质粒，表达并纯化GST
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表位重组蛋白。此外，为了提高抗原表位的效价，将不同抗原表位串联后，通过噬菌体展示技术，将其展示到噬菌体表面。通过亲和层析法纯化重组蛋白，利用建立的间接ELISA方法鉴定抗原表位。结果表明，单个肽段引入 GST载体后与合成肽OD
450nm
相比，单表位重组蛋白的免疫反应性得到了明显的增强，抗原表位完全抗原化后免疫反应性增强显著优于单个合成肽。多表位蛋白基因与噬菌体基因串联后，多表位重组蛋白免疫反应性显著优于单抗原表位完全抗原化。
[0009]在上述研究的基础上，本专利技术提出了一种非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白，其特征在于，所述的p30抗原表位蛋白选自p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、p30f、 p30g、p30I抗原表位蛋白中的任意一种或是由p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、 p30f、p30g、p30I抗原表位蛋白中任意两种以上串联后得到的多表位重组蛋白，所述的p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、p30f、p30g、p30I抗原表位蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1
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8所示。
[0010]其中，优选的，所述的p30抗原表位蛋白的一端与GST标签连接。
[0011]其中，优选的，所述的p30抗原表位蛋白是由p30c、p30d、p30e抗原表位蛋白串联后，相邻抗原表位间引入间隔子序列GGGS，然后将其编码基因序列与噬菌体AP205基因分别依次克隆至线性化的原核表达载体pET
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28a(+)，构建噬菌体展示多表位的重组表达质粒，通过大肠杆菌表达得到的GST
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多表位重组蛋白。
[0012]其中，优选的，所述的p30抗原表位蛋白是由p30g、p30I抗原表位蛋白串联后，相邻抗原表位间引入间隔子序列GGGS，然后将其编码基因序列与噬菌体 AP205基因分别依次克隆至线性化的原核表达载体pET
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28a(+)，构建噬菌体展示多表位的重组表达质粒，通过大肠杆菌表达得到的GST
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多表位重组蛋白。
[0013]进一步的，本专利技术还提出了所述的非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白在制备检测非洲猪瘟病毒抗体试剂中的用途。
[0014]其中，优选的，所述的试剂为ELISA检测试剂。
[0015]进一步的，本专利技术还提出了所述的非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白或其重组蛋白在设计、制备非洲猪瘟疫苗中的用途。
[0016]更进一步的，本专利技术还提出了一种非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA检测试剂盒，所述的试剂盒中含有以上任一项所述的非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白。
[0017]其中，优选的，所述的试剂盒中还含有稀释液、洗涤液、封闭液、HRP标记山羊抗猪IgG抗体、显色液以及终止液。
[0018]相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0019]1、利用不同的生物信息学工具筛选抗原表位得到的结果是不同的，是由于每种软件的所采用的算法不同而导致的。虽然该方法对于表位的筛选具有速度快、易于操作和成本低等优点，但是，只采用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白，其特征在于，所述的p30抗原表位蛋白选自p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、p30f、p30g、p30I抗原表位蛋白中的任意一种或是由p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、p30f、p30g、p30I抗原表位蛋白中任意两种以上串联后得到的多表位重组蛋白，所述的p30a、p30b、p30c、p30d、p30e、p30f、p30g、p30I抗原表位蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1
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8所示。2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白，其特征在于，所述的p30抗原表位蛋白的一端与GST标签连接。3.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30抗原表位蛋白，其特征在于，所述的p30抗原表位蛋白是由p30c、p30d、p30e抗原表位蛋白串联后，相邻抗原表位间引入间隔子序列GGGS，然后将其编码基因序列与噬菌体AP205基因分别依次克隆至线性化的原核表达载体pET
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28a(+)，构建噬菌体展示多表位的重组表达质粒，通过大肠杆菌表达得到的GST
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【专利技术属性】
技术研发人员：邵军军，李俊惠，刘伟，常惠芸，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：