重组肽-MHC复合物结合蛋白及其生成和用途制造技术

本发明专利技术涉及一种生产对肽

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组肽
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MHC复合物结合蛋白及其生成和用途
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年12月11日提交的EP19215436.7的优先权的权益。本专利申请的公开内容全文以引用方式并入本文用于所有目的。


[0003]本专利技术涉及一种生产对肽
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MHC(pMHC)复合物具有结合特异性的重组结合蛋白的方法。本专利技术还涉及包含一个、两个或更多个对pMHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)的重组结合蛋白，并且还涉及这样的结合蛋白：其还包含对在免疫细胞(优选T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。此外，本专利技术涉及编码此类结合蛋白或重复结构域的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于治疗或诊断疾病(包括癌症、感染性疾病和自体免疫疾病)的方法中的用途。

技术介绍

[0004]主要组织相容性复合物(MHC)I类分子在细胞内的异常或外来蛋白质的监视中起关键作用。来源于内源性蛋白的肽被装载到MHC I类分子的肽结合槽上，然后显示在细胞表面上。此类MHC I类复合物在所有有核细胞(包括恶性细胞)中表达。肽
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MHC(pMHC)复合物被CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上的T细胞受体(TCR)识别。肽
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MHC复合物的呈递提供了细胞内环境对循环CTL的快照(Reeves和James，Immunology 150:16
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24(2016))。CTL响应于检测到异常或外来抗原(例如癌蛋白，或者细菌蛋白或病毒蛋白)而被激活，导致对呈递细胞的破坏。CTL在某些自体免疫疾病中，在误识别“自身”抗原时也被激活(Bodis等人，Rheumatol.Ther.5:5
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20(2018))。
[0005]呈递肿瘤特异性或感染因子特异性肽的MHC I类复合物代表了一类独特且有前景的用于癌症和感染性疾病的免疫疗法的细胞表面靶标。已经开发了不同的方法来尝试利用这类靶标，包括疫苗、过继性细胞疗法和TCR样抗体。在这些感染因子特异性肽中，乙型肝炎病毒(HBV)核衣壳抗原的序列18
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27被具有急性自限性HBV感染的HLA
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A2阳性患者的CTL广泛识别，并且代表基于肽的治疗性疫苗的主要成分，该疫苗旨在刺激慢性乙型肝炎患者的抗病毒CTL应答(Hepatology.1997年10月；26(4):1027
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34.c)。
[0006]一直以来，治疗性开发病毒或肿瘤特异性肽
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MHC复合物的一个障碍是胸腺选择后TCR对肽
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MHC复合物的亲和力天生就低。这种低亲和力造成了限制，尤其是考虑到病毒或肿瘤特异性肽
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MHC复合物通常以低密度存在于病毒感染细胞或肿瘤细胞的表面上。为了克服该障碍，已开发了亲和力增强的TCR，并且在临床研究中测试了表达此类亲和力增强的TCR的工程化T细胞。据报道，亲和力增强的TCR可能缺乏特异性，并且在一些情况下，表达亲和力增强的TCR的工程化T细胞已经引起严重的、有时甚至致命的医疗并发症，这是由于TCR对来源于无关蛋白质的表位的意外识别(参见例如Linette等人，Blood 122(6):863
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871(2013))。亲和力增强的TCR也正被开发为可溶性TCR，但可溶性TCR的表达具有挑战性。
[0007]已经报道了许多对呈递病毒或肿瘤特异性肽的MHC I类复合物具有结合特异性的TCR样抗体。其中一些用杂交瘤技术分离。然而，通过杂交瘤技术分离pMHC特异性TCR样抗体一直以来受到许多因素的阻碍，包括需要筛选数百个或甚至数千个克隆、低免疫原性、由于免疫优势造成独特克隆很少，以及对精细特异性的控制很差(参见例如，Porgador等人，Immunity 6:715
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726(1997)；Bernardeau等人，Eur.J.Immunol.，35(10):2864
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2875(2005)；Skora等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 112(32):9967
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9972(2015))。更多的TCR样抗体已使用噬菌体展示技术分离。然而，从噬菌体展示文库分离的TCR样抗体的亲和力通常相对低，并且通常不足以用于治疗目的(参见例如Chames等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:7969
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7974(2000))。为了生成具有足够高亲和力的TCR样抗体，已经开发了用于亲和力成熟的系统。例如，一种这样的用于TCR样抗体亲和力成熟的系统将诱变、文库和酵母展示、结构测定和分子建模结合起来(Zhao等人，Leukemia 29(11):2238
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2247(2015))。Zhao等人只有采用这种复杂且劳动密集型的亲和力成熟方法，才能够将TCR样抗体的结合亲和力提高到约100倍，以获得具有足够大亲和力的pMHC特异性结合蛋白。综上所述，开发以足够大亲和力特异性地结合疾病相关肽
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MHC复合物的分子迄今为止一直具有挑战性，并且目前的方法通常涉及难以获得的表达系统和/或耗时费力的过程，诸如筛选大量杂交瘤克隆或亲和力成熟。
[0008]因此，仍然需要生产pMHC特异性结合蛋白的新方法、需要新的pMHC特异性结合蛋白，并且需要用于治疗和表征受益于pMHC特异性结合的疾病(包括癌症、自体免疫疾病和感染性疾病)的治疗和诊断方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供一种生产对肽
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MHC(pMHC)复合物具有结合特异性的重组结合蛋白的方法。本专利技术还提供包含一个、两个或更多个对pMHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域(优选经设计的锚蛋白重复结构域)的重组结合蛋白，并且还提供这样的结合蛋白：其还包含对在免疫细胞(优选T细胞)的表面上表达的蛋白具有结合特异性的结合因子。此外，本专利技术提供编码此类结合蛋白或重复结构域的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于治疗或诊断哺乳动物(包括人)的疾病(诸如癌症、自体免疫疾病和感染性疾病)的方法中的用途。
[0010]本专利技术的生产对pMHC复合物具有结合特异性的重组结合蛋白的方法在生成以高亲和力和/或特异性结合到所选择的靶标pMHC复合物的结合蛋白方面令人惊奇地有效果且有效率。开发以足够大亲和力特异性地结合疾病相关pMHC复合物的分子迄今为止一直具有挑战性，并且目前的方法通常涉及难以获得的表达系统和/或耗时费力的过程，诸如筛选大量杂交瘤克隆或亲和力成熟。本文所公开的本专利技术方法既不涉及难以获得的表达系统，也不需要耗时费力的过程，诸如上文提到的那些。此外，本专利技术的结合蛋白与靶标肽
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MHC复合物之间的结合相互作用出乎意料地涉及靶标肽中相对大量的氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产肽
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MHC(pMHC)特异性结合蛋白的方法，其中所述结合蛋白包含对靶标肽
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MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域，所述方法包括以下步骤：(a)提供经设计的重复结构域的集合；(b)提供重组的靶标肽
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MHC复合物；以及(c)筛选所述经设计的重复结构域的集合的对所述靶标肽
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MHC复合物的特异性结合，以获得至少一个对所述靶标肽
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MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经设计的重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述集合包括含有固定位置和随机化位置的经设计的重复结构域，并且其中所述集合的经设计的重复结构域在至少一个所述随机化位置上彼此不同。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述经设计的重复蛋白的集合由核糖体展示技术提供。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：(i)提供第二重组肽
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MHC复合物，其中所述第二肽
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MHC复合物的所述肽包含与所述靶标肽有至少一个氨基酸残基差异的氨基酸序列；以及(ii)通过负选择从所述集合中去除对所述第二重组肽
‑
MHC复合物具有结合特异性的经设计的重复结构域。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对靶标肽
‑
MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域在PBS中以低于10
‑7M的解离常数(K
D
)结合到所述靶标肽
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MHC复合物。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对靶标肽
‑
MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽
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MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对靶标肽
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MHC复合物具有结合特异性的所述重复结构域与所述靶标肽
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MHC复合物的结合包括所述重复结构域与所述MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MHC是MHC I类。11.一种重组结合蛋白，其包含能够通过前述权利要求中任一项所述的方法获得的经设计的重复结构域。12.一种重组结合蛋白，其包含第一经设计的重复结构域，其中所述第一重复结构域对第一靶标肽
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MHC复合物具有结合特异性，其中优选地所述第一靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽，(ii)来源于感染因子优选病毒感染因子的蛋白的肽，以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。13.根据权利要求12所述的结合蛋白，其中所述第一靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。14.根据权利要求12或13所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域在PBS中以低于10
‑7M的解离常数(K
D
)结合到所述第一靶标肽
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MHC复合物。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域与所述第一靶标肽
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MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。16.根据权利要求12至15中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域与所述第一靶标肽
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MHC复合物的结合包括所述第一重复结构域与所述第一MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。17.根据权利要求12至16中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一MHC是MHCI类。18.根据权利要求17所述的结合蛋白，其中所述MHC I类是HLA
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A*02。19.根据权利要求12至18中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一靶标肽来源于HBV核心抗原(HBcAg)。20.根据权利要求12至19中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一靶标肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:51。21.根据权利要求12至20中任一项所述的结合蛋白，其中所述第一重复结构域是经设计的锚蛋白重复结构域。22.根据权利要求21所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:27至50，以及(2)其中SEQ ID NO:27至50中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。23.根据权利要求21或22所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:16至26中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:16至26的倒数第二个位置处的A任选地被L取代并且/或者SEQ ID NO:16至26的最后一个位置处的A任选地被N取代。24.根据权利要求11至23中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含第二经设计的重复结构域，其中所述第二重复结构域对第二靶标肽
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MHC复合物具有结合特异性，其中优选地所述第二靶标肽选自由以下项组成的组：(i)来源于在肿瘤细胞中表达的蛋白的肽，(ii)来源于感染因子优选病毒感染因子的蛋白的肽，以及(iii)来源于与自体免疫疾患相关联的蛋白的肽。25.根据权利要求24所述的结合蛋白，其中所述第二靶标肽来源于病毒感染因子的蛋白，优选病毒特异性蛋白。26.根据权利要求24或25所述的结合蛋白，其中对第二靶标肽
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MHC复合物具有结合特异性的所述第二重复结构域在PBS中以低于10
‑7M的解离常数(K
D
)结合到所述第二靶标肽
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MHC复合物。27.根据权利要求24至26中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二重复结构域与所述第二靶标肽
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MHC复合物的结合包括所述第二重复结构域与所述第二靶标肽的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个氨基酸残基的相互作用。28.根据权利要求24至27中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二重复结构域与所述第二靶标肽
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MHC复合物的结合包括所述第二重复结构域与所述第二MHC的至少一个氨基酸残基的相互作用。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二MHC是MHCI类。30.根据权利要求24至29中任一项所述的结合蛋白，其中所述第二靶标肽来源于与所述第一靶标肽相同的蛋白。31.根据权利要求24至30中任一项所述的结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：分子合作伙伴股份公司，
类型：发明
国别省市：