检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法技术

本发明专利技术公开了检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，具体属于检测技术领域，该方法包括：称取样品，加入内标试剂作为内标，加入碱溶液，超声提取30min，静置8

【技术实现步骤摘要】
检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法


[0001]本专利技术属于检测
，具体涉及检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法。

技术介绍

[0002]交琏孢酚单甲醚(AME)是一种由链格孢属(Alternaria，又称交链孢属)真菌次级代谢产生的真菌毒素。体外细胞实验和动物实验发现，AME具有致癌、致畸、致突变等遗传毒性，此外，流行病学发现其与部分地区食管癌的多发呈正相关。近20年来，国内外的研究人员已在多种谷物、水果等食品中检测出AME，已报道受AME污染的食品包括小麦、大麦、燕麦、玉米、番茄、柑橘、苹果、葡萄酒等。随着研究的进一步深入，人们发现，植物体内的游离型AME可与糖类等其它分子结合，形成新的化合物，这些化学结构被修饰过的AME类真菌毒素难以通过常规方法检测出来，因此被称为隐蔽型AME。与真菌毒素原型相比，隐蔽型真菌毒素普遍存在种类繁多，化学结构复杂多变的特征，且它们的化学性质与母体相比也往往存在较大差异，因此，近年来，隐蔽型真菌毒素的检测已成为食品安全检测领域面临的一大难题。
[0003]迄今为止，国内外已发现多种不同化学结构的隐蔽型AME，由于AME在3
‑
、7
‑
位均存在自由羟基，因此，可在这2个位置分别或同时结合不同的基团，形成复杂多变的隐蔽型AME，例如：在3
‑
位或7
‑
位羟基上结合一个葡萄糖基团，形成AME的3
‑
O
‑
或7
‑
O
‑
葡萄糖苷化合物；结合在3
‑
位或7
‑
位羟基上的葡萄糖基团上还可再叠加结合其它基团，例如丙二酰基或另一个葡萄糖基；除了葡萄糖外，3
‑
O
‑
或7
‑
O
‑
位上结合的基团还有其它单糖或双糖，甚至硫酸根等。已发现其它种类的真菌毒素可与糖类(如：葡萄糖、麦芽糖)、弱酸(如：丙二酸、丙三羧酸)、肽类(如：谷胱甘肽)等多种物质结合，因此，可以预见随着研究的不断发展，还将持续有其它化学结构的隐蔽型AME被分离、鉴定出来。
[0004]目前，对于这些隐蔽型AME的检测方法，文献报道均采用直接法，即针对每个隐蔽型AME单体化合物进行检测，主要检测手段为LC
‑
MS/MS。直接法用来检测隐蔽型AME虽然精准，但面临着三大问题：一是不同的隐蔽型交琏孢酚单甲醚之间化学性质存在差异，在样品提取过程中，按照单一的提取方法，容易导致部分化合物不易被充分提取；二是对于这些隐蔽型交琏孢酚单甲醚的研究仍然处于非成熟阶段，研究人员获得的单体化合物十分有限，尚未形成商业化的各种隐蔽型交琏孢酚单甲醚标准品，而标准品的匮乏严重限制了定量检测研究的开展；三是直接法需要针对不同化学结构的每种隐蔽型交琏孢酚单甲醚分别开发检测方法，耗时耗力，技术壁垒大，且无法快速应对新发现的隐蔽型交琏孢酚单甲醚，局限性较大。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，该方法具有前处理简单、成本低、准确度和精密度高以及易于推广的优点。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，该方法包括如下步骤：
[0008]S01、样品提取：准确称取样品，加入
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C全标记的交琏孢酚单甲醚作为内标，则，记
13
C全标记的交琏孢酚单甲醚为[
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C
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]‑
AME；
[0009]标记反应完成后，加入碱溶液，振荡10～20min，超声提取20～40min，静置8
‑
12h，且调节pH至3.0
‑
5.5，得到水解型AME混合液；
[0010]S02、在水解型AME混合液中加入乙酸乙酯，振荡20～40min，于5000～10000rpm离心3～10min，得到上层有机相A和下层水相；
[0011]S03、得到的下层水相中加入乙酸乙酯，振荡30min，于10000rpm离心3min，得到上层有机相B；
[0012]S04、将上层有机相A和上层有机相B混合，氮吹浓缩至1.8～2.2mL，得到样品浓缩液；
[0013]S05、样品浓缩液过固相萃取小柱，先用正己烷淋洗固相萃取小柱，弃去淋洗液，再用甲醇洗脱固相萃取小柱，收集洗脱液，洗脱液经氮吹浓缩至0.8～1mL，经0.22μm尼龙微孔滤膜过滤后，得到上机分析液；
[0014]S06、上机分析液经高效液相色谱
‑
串联质谱检测，即LC
‑
MS/MS检测，计算得到样品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的含量。
[0015]作为优选，在步骤S01中，碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的任意一种。
[0016]作为优选，在步骤S01中，调节pH的试剂选自浓度为0.2
‑
0.5M的HCl盐酸溶液、
[0017]作为优选，在步骤S01中，静置时间为10h，调节pH至5.0。
[0018]作为优选，在步骤S02中，离心转速为8000rpm，离心时间为8min。
[0019]作为优选，在步骤S05中，淋洗液和洗脱液的流速均为1
‑
3mL/min。
[0020]作为优选，在步骤S05中，固相萃取小柱的填料选自质量比为15:6:1或18:10:0.8的硅胶、硅藻土、石墨化炭黑混合物，且填料总量为2.2
‑
3.0g，硅胶和硅藻土在使用前，于110℃烘箱中活化2
‑
3h。
[0021]作为优选，液相色谱条件为：色谱柱：C8或C18反相柱，色谱柱规格：内径2.0mm～4.6mm，柱长100mm～150mm,粒径3μm～5μm；柱温35～40℃；流动相A:含0.1％(V/V)甲酸的水溶液；流动相B：甲醇；流速:0.8mL/min～1.0mL/min；进样量5μL～10μL。
[0022]洗脱程序：梯度洗脱，流动相B初始比例为10～20％，达到100％后保持2min，再回到初始比例，平衡2min～3min，例如：0～1.0min,20％B；1.0～8.0min,20％～100％B；8.0～10.0min,100％B；10.0～13.0min,100％～20％B；13.0～15.0min,20％B。
[0023]作为优选，质谱条件为：离子源为电喷雾电离(ESI)，负离子扫描，多反应监测(MRM)模式，气帘气40psi；电喷雾电压4500V；离子源温度450℃；离子源GS1为60psi；GS2为60psi；碰撞室入口电压10V；碰撞室出口电压20V；驻留时间100ms。水解型AME的质谱检测离子对(m/z)为289/229，289/228，289/213；内标的质谱检测离子对(m/z)为304/242，3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，其特征在于，包括如下步骤：S01、样品提取：准确称取样品，加入
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C全标记的交琏孢酚单甲醚作为内标，则，记
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C全标记的交琏孢酚单甲醚为[
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C
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AME；标记反应完成后，加入碱溶液，振荡10～20min，超声提取20～40min，静置8
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12h，且调节pH至3.0
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5.5，得到水解型AME混合液；S02、在水解型AME混合液中加入乙酸乙酯，振荡20～40min，于5000～10000rpm离心3～10min，得到上层有机相A和下层水相；S03、得到的下层水相中加入乙酸乙酯，振荡30min，于10000rpm离心3min，得到上层有机相B；S04、将上层有机相A和上层有机相B混合，氮吹浓缩至1.8～2.2mL，得到样品浓缩液；S05、样品浓缩液过固相萃取小柱，先用正己烷淋洗固相萃取小柱，弃去淋洗液，再用甲醇洗脱固相萃取小柱，收集洗脱液，洗脱液经氮吹浓缩至0.8～1mL，经0.22μm尼龙微孔滤膜过滤后，得到上机分析液；S06、上机分析液经高效液相色谱
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串联质谱检测，即LC
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MS/MS检测，计算得到样品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的含量。2.根据权利要求1所述的检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，其特征在于，在步骤S01中，碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中的任意一种。3.根据权利要求1所述的检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，其特征在于，在步骤S01中，调节pH的试剂选自浓度为0.2
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0.5M的HCl盐酸溶液。4.根据权利要求1所述的检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，其特征在于，在步骤S01中，静置时间为10h，调节pH至5.0。5.根据权利要求1所述的检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，其特征在于，在步骤S02中，离心转速为8000rpm，离心时间为5min。6.根据权利要求1所述的检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，其特征在于，在步骤S05中，淋洗液和洗脱液的流速均为1
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3mL/min。7.根据权利要求1所述的检测植物源产品中隐蔽型交琏孢酚单甲醚的方法，其特征在于，在步骤S05中，固相萃取小柱的填料选自质量比为15:6:1或18:10:0.8的硅胶、硅藻土、石墨化炭黑混合物，且填料总量为2.2
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3.0g，硅胶和硅藻土在使用前，于110℃烘箱中活化2
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3h。8.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡玲，刘汉伟，杨健，朱海强，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：