基于Simoa平台检测血清中抗人TNF-α抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Simoa平台检测血清中抗人TNF

【技术实现步骤摘要】
基于Simoa平台检测血清中抗人TNF
‑
α
抗体的方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体地，本专利技术涉及一种基于Simoa平台检测血清中抗人TNF
‑
α抗体的方法。

技术介绍

[0002]Simoa(Single
‑
molecule Array，单分子阵列)技术可以在外周血中实现这些神经系统疾病标志物的准确检测。Simoa技术是由美国Quanterix公司研发生产的一款超高灵敏度单分子蛋白质检测技术，其灵敏度为ELISA技术的1000倍以上，检测下限达到fg/mL，相比传统技术，不仅提高酶底物的反应效率，且指数级降低了荧光信号的扩散和背景信号的干扰，从而提高了低丰度蛋白的检测灵敏度，实现了单分子检测的可能。
[0003]Simoa技术是将约250,000个捕获抗体包被在2.7μm的小磁珠(10种荧光标记)上，检测时加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物，通过一层油将单个磁珠封闭在4.5μm的反应孔(Well)中进行反应(避免信号扩散和交叉反应)。每238,000个Well组成一张芯片(Array)，每24个Array再组成一张光盘(Disc)，Disc数据采集使用CCD摄像头捕获这些小孔中超过阈值的检测信号，标记为“on well”和“off well”。通过计算“on well”在Array中的比例，依据泊松分布理论，计算出目的蛋白的浓度，实现数字化定量，其精确度远超ELISA的模拟定量。
[0004]肿瘤坏死因子
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α(Tumor Necrosis Factor
‑
α,TNF
‑
α)是一种促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生。TNFα受体存在于多种细胞表面，TNFα与TNFR的结合通常会引起细胞凋亡、炎症和肿瘤的发生等。其功能失调被认为与许多疾病相关，如心血管疾病、恶病质和败血症休克所致的多器官功能衰竭、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠病、移植物抗宿主病和骨髓造血紊乱综合症等。TNF
‑
α抑制剂阻止其与TNF受体的结合，从而抑制TNF的生物活性。TNF
‑
α抑制剂的毒理及药代动力学研究，对该类疾病的防治有积极的意义。
[0005]现有Simoa商用试剂盒虽然灵敏度高，但成本高昂，多用于PD标志物检测。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少高灵敏度检测血清中抗人TNF
‑
α抗体的方法，提供一种基于Simoa平台检测血清中抗人TNF
‑
α抗体的方法。本专利技术的方法使用Homebrew标记，能极大降低成本，且可以针对药动学实验进行有效检测。
[0007]本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题：
[0008]本专利技术的第一方面提供一种基于Simoa平台检测血清中抗人TNF
‑
α抗体的方法，包括：在液滴中将包被在磁珠上的捕获抗体和生物素标记的检测抗体与待测样本共孵育，加入荧光显色剂，荧光显色剂作为底物，与结合抗人TNF
‑
α抗体的检测抗体上连接的酶发生反应，产生检测信号并通过Simoa平台捕获和分析所述检测信号，所述捕获抗体为Genscript的MonoRab anti
‑
adalimumab antibody(4E12，Cat:A01921
‑
40)，所述检测抗体为
Genscript的MonoRab anti
‑
adalimumab antibody(134D5，Cat:A01922
‑
40)。
[0009]在本专利技术一些实施方案中，所述包被在磁珠上的捕获抗体的工作浓度为0.6～0.72ng/mL。
[0010]较佳地，所述包被在磁珠上的捕获抗体的工作浓度为0.72ng/mL。
[0011]在本专利技术一些实施方案中，所述磁珠的工作浓度为1.8～2.4
×
107个/mL。
[0012]较佳地，所述磁珠的工作浓度为2
×
107个/mL。
[0013]在本专利技术一些实施方案中，所述检测抗体的工作浓度为0.2～0.3ng/mL。
[0014]较佳地，所述检测抗体的工作浓度为0.25ng/mL。
[0015]在本专利技术一些实施方案中，所述生物素标记的检测抗体为NHS
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PEG4
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Biotin标记的检测抗体。
[0016]在本专利技术一些实施方案中，所述酶为链霉亲和素β
‑
乳糖酶。
[0017]较佳地，所述酶的工作浓度为30～60pM。
[0018]更佳地，所述酶的工作浓度为50pM。
[0019]在本专利技术一些实施方案中，所述底物为试卤灵a
‑
D
‑
吡喃半乳糖苷(RPG)。
[0020]在本专利技术一些实施方案中，所述方法还包括：对所述捕获抗体和所述检测抗体在使用前通过滤膜进行缓冲液置换。
[0021]较佳地，所述缓冲液置换包括：用缓冲液分别冲洗所述滤膜的两侧3～4次。
[0022]在本专利技术一些实施方案中，所述捕获抗体在0～4℃包被所述磁珠。
[0023]在本专利技术一些实施方案中，所述Simoa平台为Simoa HD
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X Analyzer。
[0024]在本专利技术一些实施方案中，所述待测样本为血清样本。
[0025]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
[0026]本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
[0027]本专利技术的积极进步效果在于：
[0028]本专利技术的方法使用Homebrew试剂分别置换捕获抗体和检测抗体，并将捕获抗体结合在活化的磁珠上，使用生物素标记检测抗体，在Simoa平台上进行检测，能极大降低成本，且可以针对药动学(PK)实验进行有效检测，灵敏度可为2ng/mL。
附图说明
[0029]图1为标准品拟合曲线截屏。
[0030]图2为标准品拟合曲线截屏。
具体实施方式
[0031]下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0032]实施例1Beads标记
[0033]置换捕获抗体buffer
[0034]1、计算80μg捕获抗体(Genscript的MonoRab anti
‑
adalimumab antibody，4E12，
Cat:A01921
‑
40)并加入到Amicon filter中预冷的Bead Conjugation Buffer，总体积为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Simoa平台检测血清中抗人TNF
‑
α抗体的方法，包括：在液滴中将包被在磁珠上的捕获抗体和生物素标记的检测抗体与待测样本共孵育，加入荧光显色剂，荧光显色剂作为底物，与结合抗人TNF
‑
α抗体的检测抗体上连接的酶发生反应，产生检测信号并通过Simoa平台捕获和分析所述检测信号，其特征在于，所述捕获抗体为Genscript的MonoRab anti
‑
adalimumab antibody(4E12，Cat:A01921
‑
40)，所述检测抗体为Genscript的MonoRab anti
‑
adalimumab antibody(134D5，Cat:A01922
‑
40)。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包被在磁珠上的捕获抗体的工作浓度为0.6～0.72ng/mL；较佳地，所述包被在磁珠上的捕获抗体的工作浓度为0.72ng/mL。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁珠的工作浓度为1.8～2.4
×
107个/mL；较佳地，所述磁珠的工作浓度为2
×

【专利技术属性】
技术研发人员：胡娟，陈建军，王鹏举，汤仁铭，朱云鹏，邹淑珍，王萌，
申请(专利权)人：上海益诺思生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：