原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统技术方案

本发明专利技术提供了一种原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统，通过采用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠进行样本前处理，并优化工艺条件，再经液相色谱

【技术实现步骤摘要】
原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统


[0001]本专利技术涉及医学诊断领域，具体的说是涉及到原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统。

技术介绍

[0002]原发性醛固酮增多症（Primary Aldosteronism，PA）是由于肾上腺自主分泌过多醛固酮，而导致体内潴钠排钾，血容量增多，肾素
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血管紧张素系统活性受到抑制，临床上表现为高血压伴或不伴低血钾。根据国内最新研究显示PA在新诊断高血压中的发生率超过4%，在难治性高血压人群中为17~23%。与原发性高血压患者相比，PA患者发生动脉粥样硬化、心肌梗死、周围血管疾病、中风和慢性肾脏损害的风险更高，且容易漏诊和误诊，因此早期诊断、早期治疗至关重要。醛固酮瘤（APA）和双侧特发性醛固酮增多症（IHA）是PA最常见的两种形式，前者可通过肾上腺手术治愈，并改善动脉高血压；对于拒绝或不适合手术的患者，药物干预是一种有效的选择。
[0003]PA的诊断包括筛查、确诊和分型诊断。醛固酮/肾素活性 (ARR)是PA的首选筛查指标。对于筛查阳性患者可以通过口服高钠饮食、氟氢可的松试验(FST)、生理盐水试验(SIT)或卡托普利试验（CCT）进行确诊，并通过肾上腺CT、肾上腺静脉取血(adrenal venous sampling，AVS)等方式区分单侧优势或双侧均势PA。其中，有以下几方面的原因会对PA的准确诊断存在干扰：1）检测方法：醛固酮/肾素活性(ARR)的检测是目前常用的PA生化检测指标，但是不同的检测方法会影响ARR检测值的准确性，尤其是醛固酮的定量结果，贯穿于筛查、诊断和分型诊断的全流程，目前醛固酮的测量主要有放射免疫法或化学发光法，虽然该方法快速且易于执行，但是这些方法均具有交叉反应性和实验室间可比性差等缺点。除了检验方法没有可比性和缺乏标准化之外，在肾功能损害的情况下，使用免疫法会导致醛固酮检测结果明显高估，IA显示中位阳性偏倚为127%，推测是因为抗体与未清除的醛固酮代谢物交叉反应。这种作用不仅限于终末期肾衰竭，而且在轻度或中度肾功能不全的患者中也以分级的方式发生。因此常常出现检测结果与临床表现不一致的现象，影响了临床医生对继发性高血压的病因筛查与鉴别诊断，甚至导致PA患者的误诊或漏诊。
[0004]2）治疗药物干扰根据国内外指南推荐，醛固酮/肾素活性检测是筛查原发性醛固酮增多症的首选生化指标，但是人体的肾素
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血管紧张素
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醛固酮系统极易受到饮食、药物的影响，在进行筛查时需要停用常规降压药（如钙离子拮抗剂、血管紧张素酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、利尿剂等）4
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6周，造成筛查结果的假阳性或假阴性，给临床开展筛查项目造成一定的困难。这在本申请人的在先申请的专利技术专利2021106374412中得到解决，如何来排除假阳性以及假阴性的药物干扰。
[0005]3）鉴别诊断
在内分泌性高血压的鉴别诊断中，往往也存在其他盐皮质激素过量而导致的高血压，与原发性醛固酮增多症存在相似临床症状，这在一定程度上给临床诊断带来了一定的干扰和困难。例如由遗传性或获得性（甘草摄入）11
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βHSD酶抑制所引起的其他盐皮质激素增多引起的低肾素高血压；甘草消耗过量导致的假性醛固酮增多症；库欣综合征；DOC分泌瘤等。这些临床症状与PA相似，但并不是PA，从而为准确诊断PA造成了很多干扰。
[0006]因此急需找到更为准确的PA诊断、筛查、分型方面的试剂盒以及一体化的系统。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种原发性醛固酮增多症筛查试剂盒以及确诊和分型诊断系统，通过表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠对样本中待测物进行提取，再经液相色谱
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串联质谱技术一次性检测样本中的醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18
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羟皮质酮5种标志物含量，计算ARR值，并结合ARR的切点值20.4，和影响ARR的高血压治疗药物浓度来判断；判断为阳性时，再根据标志物的检测值进行PA分型，从而实现同一平台、同时检测醛固酮等5种标志物含量，建立PA筛查与确诊的临床切点，进行PA的准确诊断和分型，使继发于原醛的高血压患者在早期就能得到甄别与确诊，为临床医生制定有效的治疗干预措施治疗提供可靠的实验室检查依据。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种原发性醛固酮增多症检测试剂盒，所述试剂盒包括活化剂、平衡液、淋洗液和洗脱液；所述活化剂为含有磁珠的溶液，所述磁珠的表面键合亲水亲脂平衡聚合物。所述磁珠用于吸附样品中的标志物，所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18
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羟皮质酮中的任意一种或多种。
[0009]本专利技术通过对系列特异性标志物的准确血液含量的检测，为随后的筛查以及分型提供良好的基础。为了实现准确检测，首先需要对样本中的标志物进行准确提取，再配合后续的精确检测，才能真正反应血液样本中各个标志物的真实含量。
[0010]本专利技术所述标志物包括醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇、18
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羟皮质酮共5种标志物。现有的原发性醛固酮增多症检测试剂盒最多只能通过检测3种标志物来进行原发性醛固酮增多症的诊断，本专利技术首次开创了通过5种标志物一步法检测来实现更准确的原发性醛固酮增多症的筛选、确诊和分型。
[0011]针对醛固酮、血管紧张素Ⅰ的检测，本课题组原先是采用分别前处理、单独进样的方式进行；在进行醛固酮、血管紧张素I及血管紧张素II三个指标的同步检测时，是采用96孔SPE板（Agela PEP 96 Well Microplates）进行固相萃取柱萃取。在SPE板经活化及平衡后，将待测生物样品溶液上样至SPE板，固定相选择性提取吸附目标成分，通过淋洗将部分干扰成分洗掉，再利用与固定相结合能力更强的洗脱剂将目标组分从萃取柱洗脱，达到分离和净化的目的，其缺点是操作过程步骤较繁琐、耗时较长，包括活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，单批样本处理耗时两小时左右，而且由于生物样本基质差异性，样本孔间提取效率差异较大，所有指标均需使用同位素内标进行校准；另外由于生物样本基质特异性，部分样本（尤其是溶血、脂血等样本）可能引致SPE柱堵塞，导致整批样本的前处理效率降低以及堵塞样本的复测。为了更进一步实现原醛病人分型诊断而增加新的检测指标18羟皮质酮及皮质醇后，由于18羟皮质酮的含量及质谱响应均较低，对前处理过程富集效率和净化效果提出了更高的要求。
[0012]因此，考虑采用分散固相萃取法进行样本处理，分散固相萃取将具有特定吸附选择性的固体吸附材料分散于生物样品溶液中，震荡混匀使样品溶液中的目标成分在液相和选择性吸附的固相之间达到平衡，根据固体吸附材料的选择性达到选择性吸附提取目标物的目的，其最主要的缺点是将固相与溶液分离的过程比较复杂。
[0013]为了进一步解决分散固相萃取法存在的固相与溶液分离过程太复杂的问题，本专利技术最终采用了具有特异提取吸附本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原发性醛固酮增多症检测试剂盒，其特征在于，包括活化剂、淋洗液和洗脱液；所述活化剂为含有磁珠的溶液，所述磁珠的表面键合亲水亲脂平衡聚合物；所述磁珠用于吸附样品中的标志物，所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇和18
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羟皮质酮。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为含50%甲醇的水溶液。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述淋洗液包括淋洗液1和淋洗液2，淋洗液1为10%甲醇水溶液，淋洗液2为异辛烷；活化剂为含有磁珠的50%乙醇水溶液；所述磁珠为有磁性的核壳固相萃取颗粒，颗粒度30
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50
µ
m，比表面积约600m2/g，孔径约为80A。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括平衡液和液相色谱流动相，所述平衡液为1%甲酸水溶液；所述液相色谱流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含有流动相添加剂的水溶液，流动相B为含有流动相添加剂的甲醇溶液（含5%异丙醇），所述流动相添加剂为1mM氟化铵。5.一种检测血液中的标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠处理样品，吸附待测物；（2）用洗脱液洗脱待测物，液相色谱串联质谱分析待测物中的标志物的含量；所述标志物为醛固酮、血管紧张素Ⅰ、血管紧张素Ⅱ、皮质醇和18
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羟皮质酮。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）为：所述样品需先经添加血管紧张素转换酶抑制剂（PMSF）的生成缓冲液在酸性条件进行孵育，孵育结束后加入反应终止液终止孵育，再采用表面键合亲水亲脂平衡聚合物的磁珠处理孵育后样品；所述生成缓冲液的pH值为5
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6。7.如权利要求6所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏云，袁小芬，马金飞，孔子青，李义坤，吴卫甲，刘华芬，
申请(专利权)人：杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：