一种用于中药肝毒性评价的基于微流控体系的精密肝切片培养模型制造技术

本发明专利技术公开了一种用于中药肝毒性评价的基于微流控体系的精密肝切片培养模型，涉及生物技术领域。所述模型的构建方法为基于微流控培养体系的建立，所述微流控培养的步骤为：PET膜的底面经黏附蛋白预处理后，接种HUVECs细胞，12h后，在所述PET膜的上面接种精密肝切片，开启微量蠕动泵，培养12h后，以不同浓度的中药提取物为循环液进行灌流，同时芯片培养小室内加入含有所述中药提取物的培养液，继续培养24h后，取培养液上清对肝损伤标记物进行检测，并对精密肝切片进行形态学观察。本发明专利技术针对中药肝毒性评价中的问题，利用微流控技术建立精密肝切片培养体系，保存了肝脏的组织结构，可将之应用于中药的肝毒性评价。将之应用于中药的肝毒性评价。将之应用于中药的肝毒性评价。

【技术实现步骤摘要】
一种用于中药肝毒性评价的基于微流控体系的精密肝切片培养模型


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于中药肝毒性评价的基于微流控体系的精密肝切片培养模型。

技术介绍

[0002]肝脏是药物在体内代谢的最主要场所，药物在此进行聚合、氧化、还原、羟化以及去甲基化等一系列的代谢过程。从而，在全身诸多脏器发挥效应，因而肝脏也成为最容易遭受药物损害的靶器官。美国FDA公布数据显示，肝毒性研究处于所有药物不良反应的首位。文献研究显示，中草药所致肝损害占临床报道的药物性肝损伤病例30％以上，其病理损伤类型主要有肝细胞变性、坏死、胆汁淤积和肝血管病变等。由于肝脏是体内进行生物转化的重要场所，因而无论是哪种病变，都会给机体带来巨大影响，若病程持续则可危害生命。
[0003]对于临床医师来说，直接诊断药物性肝病是很困难的，这种诊断只能在肝损害发生后。因此，充分的临床前药物毒性研究，是减少药物性肝损伤发生的最有效途径。目前用于研究中药对肝脏损伤作用机制、药物代谢及作用物质基础的技术手段大部分仍停留在动物的体内研究和体外细胞培养这两种方式。体内研究能够全面反应药物在整体环境下对机体的毒性反应，但方法敏感性差，较难实现肝脏毒性的早期预警和快速检测；体外研究具有周期短，节约动物，可控性强，能够实现高通量筛选等优点。目前应用于中药研究最多的体外技术手段当推肝细胞体外培养技术，然而体外肝细胞不能完全保持肝脏的组织特异性功能，药物代谢酶谱表达不完全，而且随着培养时间的延长，细胞的基因型和表现型容易发生偏离。且随着科学技术手段的发展，一些传统意义上“无毒”的中药逐渐发现具有潜在和实际的肝毒性，如何首乌、麦冬、苍术、甘草、柴胡等等，面对日益彰显的中药不良反应问题，常规方法不能解决问题，亟需建立一些更为高效、敏感的中药临床前安全性评价方法与技术体系来研究中药的肝毒性问题。
[0004]微流控芯片技术(Microfluidics)也被称为芯片实验室(Lab
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Chip，LOC)，其研究领域涉及物理、化学、医学、流体、电子、材料、机械等多学科。通过微通道、反应室和其他某些功能部件的有效集合，并通过与一体化检测平台的有效结合，可以实现个性化检测，具有液体流动可控、集成化、消耗低、通量高、分析快等优点，已经被广泛应用于生物医学领域。基于微流控芯片技术的人体器官芯片(Human organs
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chips)近几年来发展迅速，已经实现肺、肾、肠、肝、心脏、血管、皮肤、大脑、骨骼、乳腺、脾脏、血脑屏障、气血屏障等芯片的构建，可体外模拟多种活体细胞、组织器官微环境，反映人体组织器官的主要结构和功能特征。
[0005]目前，国内外还没有用于专门进行中药肝毒性检测的基于微流控体系的精密肝切片培养模型的研究报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于中药肝毒性评价的基于微流控体系的精密肝切片培养模型，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术将精密肝切片培养于微流控体系之中，建立基于微流控培养的精密肝切片模型，并检测具有肝毒性的中药提取物对肝损伤标记物和细胞形态学的影响，同时与培养于微流控体系的单一细胞和非微流控体系的精密肝切片做对比，以明确本专利技术建立的培养模型的敏感性和准确性。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0008]本专利技术提供一种用于中药肝毒性评价的基于微流控体系的精密肝切片培养模型，所述模型的构建方法包括以下步骤：
[0009](1)微流控体系的安装
[0010]所述微流控体系的芯片为五层四通道结构：第一层为PC材质的芯片培养小室，第二层为细胞培养室底部PET膜的上面，所述第一次和第二层构成整个芯片的上层，用于精密肝切片的培养；第三层为所述PET膜的底面，用于HUVECs细胞的培养，第四层为PC材质的芯片流道板，所述流道板上层为所述芯片培养小室的基座，下层包含豆荚状流道，为培养液的流动层，所述第三层和第四层构成整个芯片的中层；第五层为PMMA材质薄膜，构成了整个芯片的下层；将所述芯片流道板与所述PMMA薄膜进行紧密封接，整个芯片的上层和中层之间不进行封接，直接进行各个部件组装后，通过灌流管路系统连接微量蠕动泵及控制器，从而构成一个芯片结构；
[0011](2)微流控培养
[0012]所述PET膜的底面经黏附蛋白预处理后，接种HUVECs细胞，12h后，在所述PET膜的上面接种精密肝切片，开启微量蠕动泵，培养12h后，以不同浓度的中药提取物为循环液进行灌流，同时所述芯片培养小室内加入含有所述中药提取物的培养液，继续培养24h后，取培养液上清对肝损伤标记物进行检测，并对培养后的肝切片进行形态学观察。
[0013]进一步地，在步骤(2)中，所述黏附蛋白的预处理时间为3h。
[0014]进一步地，在步骤(2)中，所述微量蠕动泵的流速为251μL/min。
[0015]进一步地，在步骤(2)中，所述HUVECs细胞的接种密度为5
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105个/mL。
[0016]进一步地，在步骤(2)中，所述精密肝切片的制备方法包括：在无菌条件下取出肝脏，置于预先以氧饱和的DMEM培养液中，持续通氧，于肝右叶中间部位切取一块肝组织，之后用琼脂糖包埋，最后切片，得到所述精密肝切片。
[0017]进一步地，所述精密肝切片的厚度为300μm。
[0018]进一步地，在步骤(2)中，所述肝损伤标记物包括ALT、LDH、GGT、TG、TBIL和TBA。
[0019]进一步地，在步骤(2)中，所述形态学观察包括精密肝切片和HUVECs细胞的HE染色。
[0020]本专利技术公开了以下技术效果：
[0021]本专利技术针对中药肝毒性评价中的问题，利用微流控技术建立精密肝切片培养体系，并将之应用于中药的肝毒性评价。该系统的突出特点在于肝芯片中使用3D培养的精密肝切片，精密肝切片技术是一种介于器官与细胞水平之间、融体内外检测技术为一体的先进技术方法，相较于单一细胞或几种细胞的共培养体系，它的优点是保存了肝脏的组织结构，一个肝切片包含了肝组织内所有类型的细胞，并保存了完好的细胞基质和细胞间的结
构，其代谢能力接近整体器官。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1为肝器官微流控芯片结构图；
[0024]图2为不同培养体系下雷公藤提取物对培养上清中ALT含量的影响；
[0025]图3为不同培养体系下雷公藤提取物对培养上清中LDH含量的影响；
[0026]图4为不同培养体系下雷公藤提取物对培养上清中GGT含量的影响；
[0027]图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于中药肝毒性评价的基于微流控体系的精密肝切片培养模型，其特征在于，所述模型的构建方法包括以下步骤：(1)微流控体系的安装所述微流控体系的芯片为五层四通道结构：第一层为PC材质的芯片培养小室，第二层为细胞培养室底部PET膜的上面，所述第一次和第二层构成整个芯片的上层，用于精密肝切片的培养；第三层为所述PET膜的底面，用于HUVECs细胞的培养，第四层为PC材质的芯片流道板，所述流道板上层为所述芯片培养小室的基座，下层包含豆荚状流道，为培养液的流动层，所述第三层和第四层构成整个芯片的中层；第五层为PMMA材质薄膜，构成了整个芯片的下层；将所述芯片流道板与所述PMMA薄膜进行紧密封接，整个芯片的上层和中层之间不进行封接，直接进行各个部件组装后，通过灌流管路系统连接微量蠕动泵及控制器，从而构成一个芯片结构；(2)微流控培养所述PET膜的底面经黏附蛋白预处理后，接种HUVECs细胞，12h后，在所述PET膜的上面接种精密肝切片，开启微量蠕动泵，培养12h后，以不同浓度的中药提取物为循环液进行灌流，同时所述芯片培养小室内加入含有所述中药提取物的培养液，继续培养24h后，取培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘婷，杨依霏，夏冰，赵春晖，李春，宫平，齐莹，赵晓昂，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：