制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法技术

本发明专利技术涉及制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法。制备肺炎球菌荚膜多糖的方法包括提供选定血清型的肺炎球菌溶解产物；去除溶解产物中的蛋白质和核酸，去除蛋白质和去除核酸在分开的步骤中不按序地进行；去除蛋白质的步骤包括I)将待处理的样品与脱氧胆酸钠混合，使该混合体系的pH为3

【技术实现步骤摘要】
制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体而言，涉及制备肺炎球菌荚膜多糖和肺炎球菌疫苗的方法。

技术介绍

[0002]肺炎球菌是呼吸道感染的首要致病菌，既是引起儿童社区获得性肺炎最常见的病原菌，也是致使老年人致命性肺炎感染的主要病原菌。目前发现90余个血清型，其中约30个血清型的菌株对人类有致病性。荚膜多糖是肺炎球菌的主要毒力因子，研究结果表明，肺炎球菌荚膜多糖疫苗具有良好的免疫原性和安全性。
[0003]现有的肺炎球菌荚膜多糖纯化方法一般采用苯酚抽提法和乙醇分级沉淀法。然而苯酚对人体和环境均有危害，乙醇在操作和存储方面也存在重大安全隐患，对生产厂房的要求极高，增加了生产成本。

技术实现思路

[0004]为解决上述现有技术中所存在的问题，本专利技术提供了制备肺炎球菌荚膜多糖的方法和制备肺炎球菌疫苗的方法。
[0005]具体而言，本专利技术提供了：
[0006](1)一种制备肺炎球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：
[0007]1)提供选定血清型的肺炎球菌的溶解产物；
[0008]2)去除所述溶解产物中的蛋白质和核酸，其中去除蛋白质和去除核酸在分开的步骤中不按序地进行；
[0009]其中去除蛋白质的步骤包括：
[0010]I)将待处理的样品与脱氧胆酸钠混合，并使该混合体系的pH为3
‑
6，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6
‑
8，得到第一上清液；
[0011]II)去除所述第一上清液中的脱氧胆酸钠；
[0012]其中去除核酸的步骤包括：
[0013]A)将待处理的样品与二价盐混合，并使该混合体系的pH为1
‑
4，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6
‑
8，得到第二上清液；
[0014]B)去除所述第二上清液中的在步骤A)中所添加的二价盐；其中：
[0015]当去除蛋白质在去除核酸之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物，步骤A)所述待处理的样品为步骤II)所得去除脱氧胆酸钠的液体；
[0016]当去除核酸在去除蛋白质之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为步骤B)所得去除在步骤A)中所添加的二价盐的液体，步骤A)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物。
[0017](2)根据(1)所述的方法，其中在步骤I)中，所述脱氧胆酸钠在所述混合体系中的终浓度为0.1
‑
2％(w/v)。
[0018](3)根据(1)所述的方法，其中在步骤I)中，在pH 3
‑
6下用脱氧胆酸钠处理所述样品的时间为5
‑
30分钟，温度为18
‑
30℃。
[0019](4)根据(1)所述的方法，其中重复进行步骤I)1
‑
4次。
[0020](5)根据(1)所述的方法，其中在步骤A)中，所述二价盐在所述混合体系中的终浓度为0.03
‑
1mol/L。
[0021](6)根据(1)所述的方法，其中在步骤A)中，在pH 1
‑
4下用二价盐处理所述样品的时间为5
‑
30分钟，温度为18
‑
30℃。
[0022](7)根据(1)所述的方法，其中步骤I)和A)中所述的离心在3000g以上的离心力下进行10分钟以上。
[0023](8)根据(1)所述的方法，其中步骤II)所述的去除脱氧胆酸钠和步骤B)所述的去除在步骤A)中所添加的二价盐采用超滤浓缩进行；优选地，用截留分子量为100Kd
‑
300Kd的超滤膜进行所述超滤浓缩。
[0024](9)根据(1)所述的方法，其中所述肺炎球菌荚膜多糖选自1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。
[0025](10)根据(1)所述的方法，其中所述二价盐包括氯化钙和氯化镁。
[0026](11)一种制备肺炎球菌疫苗的方法，包括利用(1)至(10)中任一项所述方法制得的肺炎球菌荚膜多糖制备肺炎球菌疫苗。
[0027](12)根据(11)所述的方法，其中所述肺炎球菌疫苗包括多糖疫苗和结合疫苗。
[0028]本专利技术与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0029]1.本专利技术通过简单地采用脱氧胆酸钠和二价盐的组合来纯化肺炎球菌荚膜多糖，同时巧妙地利用在不同pH值下脱氧胆酸钠与蛋白混合溶液的浊度变化来可视化地且准确地判断蛋白质去除效果，实现了优秀的肺炎球菌荚膜多糖纯化效果，所得肺炎球菌荚膜多糖的纯度高。
[0030]2.本专利技术摸索优化了各步骤的条件，进一步提高了纯化效果和效率。
[0031]3.本专利技术的整个纯化工艺仅需3
‑
4天，缩短了工艺时间，降低了生产成本。
[0032]4.本专利技术的工艺操作简便，可实现自动化、管道化的大规模放大。
[0033]5.避免了苯酚和乙醇的使用，消除了安全隐患，产品更加安全环保。
附图说明
[0034]图1示出脱氧胆酸钠浓度对蛋白质去除步骤的影响；
[0035]图2示出pH对蛋白质去除步骤的影响；
[0036]图3示出离心力对蛋白质去除步骤的影响；
[0037]图4示出离心时间对蛋白质去除步骤的影响；
[0038]图5示出氯化钙浓度对核酸去除步骤的影响；
[0039]图6示出pH对核酸去除步骤的影响；
[0040]图7示出离心力对核酸去除步骤的影响；
[0041]图8示出离心时间对核酸去除步骤的影响；
[0042]其中，在图1
‑
8中，图A示出1型肺炎球菌荚膜多糖的结果，图B示出5型肺炎球菌荚膜多糖的结果；图C示出9V型肺炎球菌荚膜多糖的结果；图D示出18C型肺炎球菌荚膜多糖的
结果。
具体实施方式
[0043]以下通过具体实施方式的描述对本专利技术作进一步说明，但这并非是对本专利技术的限制，本领域技术人员根据本专利技术的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本专利技术的基本思想，均在本专利技术的范围之内。
[0044]本专利技术提供了一种制备肺炎球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：
[0045]1)提供选定血清型的肺炎球菌的溶解产物；
[0046]2)去除所述溶解产物中的蛋白质和核酸，其中去除蛋白质和去除核酸在分开的步骤中不按序地进行；
[0047]其中去除蛋白质的步骤包括：
[0048]I)将待处理的样品与脱氧胆酸钠混合，并使该混合体系的pH为3
‑
6，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6
‑
8，得到第一上清液；
[0049]II)去除所述第一上清液中的脱氧胆酸钠；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备肺炎球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：1)提供选定血清型的肺炎球菌的溶解产物；2)去除所述溶解产物中的蛋白质和核酸，其中去除蛋白质和去除核酸在分开的步骤中不按序地进行；其中去除蛋白质的步骤包括：I)将待处理的样品与脱氧胆酸钠混合，并使该混合体系的pH为3
‑
6，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6
‑
8，得到第一上清液；II)去除所述第一上清液中的脱氧胆酸钠；其中去除核酸的步骤包括：A)将待处理的样品与二价盐混合，并使该混合体系的pH为1
‑
4，离心得到上清液，将该上清液的pH调至6
‑
8，得到第二上清液；B)去除所述第二上清液中的在步骤A)中所添加的二价盐；其中：当去除蛋白质在去除核酸之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物，步骤A)所述待处理的样品为步骤II)所得去除脱氧胆酸钠的液体；当去除核酸在去除蛋白质之前进行时，步骤I)所述待处理的样品为步骤B)所得去除在步骤A)中所添加的二价盐的液体，步骤A)所述待处理的样品为所述肺炎球菌溶解产物。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤I)中，所述脱氧胆酸钠在所述混合体系中的终浓度为0.1
‑
2％(w/v)。3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤I)中，在pH 3
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6下用脱氧胆酸钠处理所述样品的时间为5
‑
30分钟，...

【专利技术属性】
技术研发人员：任克明，张轶，张新庄，李阿妮，任珍芸，罗树权，
申请(专利权)人：兰州生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：