一种提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，尤其涉及一种提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法。本发明专利技术将一种非离子型表面活性剂Tri tonX

【技术实现步骤摘要】
一种提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法。

技术介绍

[0002]熊去氧胆酸，化学名称为3a,7β
‑
二羟基
‑
5β
‑
胆甾烷
‑
24
‑
酸，英文名称为 Ursodeoxycholic acid，UDCA。是传统的中药的有效成分，有着非常广泛的临床应用和卓越的药用价值，在治疗胆结石，促进肝移植，胆汁反流性胃炎，酒精肝，胆汁性肝硬化，和药物诱发的肝炎方面有非常好的疗效，市场用量很大。
[0003]近年来，联合应用7α
‑
HSDH和7β
‑
HSDH将CDCA为底物两步法生成UDCA，成为研究热点，目前已经有研究的综合转化率能超过90％，但反应量仅为毫升级别，距离工业化生产还有很大距离。主要的限制性瓶颈为：
[0004]1)以CDCA为底物两步法中的关键酶7β
‑
HSDH极度不稳定，尽管酶活够高，但在催化反应体系中会快速失活；
[0005]2)反应体系能够承载的底物量太低(体积比1％)，体系不稳定。

技术实现思路

[0006]为解决上述现有技术中存在的7β
‑
HSDH极度不稳定，底物浓度太低和无法实现工业化生产的问题，本专利技术提供了一种提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法，在成功构建异源表达7β
‑
HSDH的基础上，主要从提高7β
‑
HSDH酶催化性能方面着手，发现了非离子型表面活性剂TritonX
‑
100对7β
‑
HSDH酶稳定性和催化性能都有较大提高，并提高了底物承载能力，使其适应酶催化的工业化生产过程。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法，包括以下几个步骤
[0009](1)将培养好的7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌离心收集菌体，即用或4℃保存。
[0010](2)加入7
‑
酮石胆酸10g/L～100g/L，用NaOH化清。
[0011](3)加入5g/L～60g/L葡萄糖，搅拌溶解。
[0012](4)调节体系温度为4～30℃，pH为7.0～9.0。
[0013](5)加入7β
‑
羟基类固醇脱氢酶10g/L～50g/L，葡萄糖脱氢酶2g/L～ 100g/L，搅拌均匀。
[0014](6)加入5g/L～70g/L TritonX
‑
100，搅拌均匀后用纯水补足反应体系。
[0015](7)加入NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸nicotinamide adeninedinucleotide phosphate)0.01g/L～0.1g/L，开始反应。过程维持体系温度为4～30℃，pH为7.0～9.0。
[0016]所用7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌为前期研究构建，工程菌菌的宿主菌为 Escherichia coli BL21(DE3)，重组质粒为pET28a
(+)
。
[0017]所述7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为
CCTCC NO:M20211645，保藏日期为2021年12月27，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，菌株命名为Escherichia coli BL21(DE3)
‑
pE T28a
(+)
‑
V31。
[0018]所述培养7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌的具体方法包括以下步骤：
[0019]1)将工程菌接种到LB固体平板培养基中，进行活化培养；
[0020]2)从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有50mg/L卡那霉素LB 液体培养基中，进行培养；
[0021]3)将上一步所得培养物转接到含有50mg/L卡那霉素的TB液体培养基，进行培养；
[0022]4)在上一步所得培养物中加入异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷，继续培养。
[0023]步骤1)中，所述LB固体平板培养基包括以下组分：胰蛋白胨8～12g/L、酵母提取物3～8g/L、氯化钠8～12g/L、琼脂粉12～18g/L；于37℃活化培养 16～20h。
[0024]步骤2)中，所述LB液体培养基包括以下组分：胰蛋白胨8～12g/L、酵母提取物3～7g/L、氯化钠8～12g/L；在200rpm/min、37℃下震荡培养16～20h。
[0025]步骤3)中，所述TB液体培养基包括以下组分：胰蛋白胨10～15g/L、酵母提取物20～30g/L、甘油3～8g/L、磷酸氢二钾6～10g/L、磷酸二氢钾1～3g/L；在200rpm/min、37℃下震荡培养4～6h。
[0026]步骤4)中，异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷的加入量为0.2
‑
0.6mM，25℃下继续培养10～16h。
[0027]所用葡萄糖脱氢酶购自安琪酵母。
[0028]所用非离子型表面活性剂TritonX
‑
100，购自生工生物(上海)股份有限公司。
附图说明
[0029]图1是实施例2的液相检测图谱；
[0030]图2是实施例5的液相检测图谱。
[0031]有益效果
[0032]催化7
‑
酮石胆酸生成熊去氧胆酸的7β
‑
羟基类固醇脱氢酶在实际应用中存在底物承载量低，极度不稳定，底物转化率低的问题。本专利技术将一种非离子型表面活性剂TritonX
‑
100添加到反应体系中，极大提高了7β
‑
羟基类固醇脱氢酶的催化效率，极大延长7β
‑
羟基类固醇脱氢酶的稳定期，增大底物承载量，且在一定浓度范围内与TritonX
‑
100用量正相关。加入TritonX
‑
100后酶催化效率极大提高，熊去氧胆酸生成率从30％提高到了96％，且底物浓度从5％提高到了7％，可应用于大规模的工业化生产。本专利技术提高了酶催化生产熊去氧胆酸的效率，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
[0033]以下，将详细地描述本专利技术。在进行描述之前，应当理解的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的术语不应解释为限制于一般含义和字典含义，而应当在允许专利技术人适当定义术语以进行最佳解释的原则的基础上，根据与本专利技术的技术方面相应的含义和概念进行解释。因此，这里提出的描述仅仅是出于举例说明目的的优选实例，并非意图限本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌；(2)将培养好的7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌离心收集菌体，得到7β
‑
羟基类固醇脱氢酶，备用；(3)在反应体系中加入7
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酮石胆酸，用NaOH化清；(4)在反应体系中加入葡萄糖，搅拌溶解；(5)在反应体系中加入步骤(2)所得的7β
‑
羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶，搅拌均匀；(6)在反应体系中加入TritonX
‑
100，搅拌均匀后用纯水补足反应体系；(7)加入NADP，开始反应；所述7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20211645。2.根据权利要求1所述的提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养7β
‑
羟基类固醇脱氢酶工程菌的具体方法包括以下步骤：1)将工程菌接种到LB固体平板培养基中，进行活化培养；2)从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有50mg/L卡那霉素LB液体培养基中，进行培养；3)将上一步所得培养物转接到含有50mg/L卡那霉素的TB液体培养基，进行培养；4)在上一步所得培养物中加入异丙基
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β
‑
D
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硫代吡喃半乳糖苷，继续培养。3.根据权利要求2所述的提高酶催化生产熊去氧胆酸效率的方法，其特征在于，步骤1)中，所述LB固体平板培养基包括以下组分：胰蛋白胨8～12g...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：北京岳达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：