两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法。包括：第一步：牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）通过化学氧化反应制备得到牛磺7

【技术实现步骤摘要】
两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种制备牛磺熊去氧胆酸的方法，特别涉及通过两步法制备牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的方法，即将天然来源的牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）先通过化学氧化，生成牛磺7
‑
酮石胆酸(T7K)后，再通过大肠杆菌共表达全细胞催化将牛磺7
‑
酮石胆酸转为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法，属于化学合成


技术介绍

[0002]牛磺熊去氧胆酸（TUDCA），化学名为2
ꢀ‑
[[（3α，5β，7β）
‑
3，7
‑
二羟基
‑
24
‑
氧代胆甾烷
‑
24
‑
基]氨基]乙烷磺酸二水合物，是由熊去氧胆酸（UDCA）的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。1902年自熊胆中发现TUDCA，其为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。意大利贝思迪大药厂于1991年上市该药物，2007年以商品名滔罗特（taurolite）获准在中国销售，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。临床研究表明，牛磺熊去氧胆酸与熊去氧胆酸相比，溶石速度加快、全溶率提高，且无明显的不良反应。
[0003]牛磺熊去氧胆酸是熊胆汁的有效成分，治疗胆结石及肝病具有明显的疗效。近年来，有关牛磺熊去氧胆酸的研究领域一直非常活跃，其化学合成也倍受关注。国内基本以人工提取熊胆汁为主要途径得到牛磺熊去氧胆酸，来源有限，不利于大规模生产。化学合成牛磺熊去氧胆酸，国外报道主要有三种化学半合成法：
①
用熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯或特戊酰氯反应形成混合酸酐，在碱性条件下与牛磺酸反应，再经离子交换柱纯化制得TUDCA，总收率约62%。
[0004]②
熊去氧胆酸和牛磺酸在碱性条件下分别在N
‑
乙氧羰基
‑2‑
乙氧基
‑
1，2
‑
二氢喹啉（EEDQ）或氰基磷酸二乙酯（DEPC）作用下直接缩合得到，收率分别为67%和90%，此法试剂价昂。
[0005]③
熊去氧胆酸和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后，与对羟基苯丙酮缩合，得熊去氧胆酸的活性酚酯，再与牛磺酸反应制得TUDCA，总收率约64%，此法反应步骤较多。
[0006]比较三种合成方法，后两种需用EEDQ和DEPC，价格昂贵，制备也较烦琐。牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）是一种广泛存在于鸡鸭鹅等禽畜胆汁中，人们利用较多的，是将这些胆汁水解制备鹅去氧胆酸，而利用结合态TCDCA制备TUDCA的方法报导不多。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种通过两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法，本专利技术主要利用来源广泛的TCDCA，先通过化学氧化生产牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑
7K)，然后7β
‑
类固醇脱氢酶（7β
‑
HSDH）将牛磺7
‑
酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，同时共表达或融合表达的葡萄糖脱氢酶在葡萄糖存在的情况下将NADP
+
循环再生。上述方法中两种酶蛋白共表达，且催化过程全细胞催化，保证高活性的同时使酶蛋白具体更好的稳定性，能够实现高收率、高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备。本专利技术所述方法的原理如图1所示。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法，包括：第一步：牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）通过化学氧化反应制备得到牛磺7
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酮石胆酸(T
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7K)；第二步：将第一步制备得到的牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑
7K)通过共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
‑
HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞催化还原生产得到牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）。
[0009]其中，优选的，第一步反应包括如下步骤：取牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA），按照1g牛磺鹅去氧胆酸加入1ml甲醇的量加入甲醇，溶解后，加入牛磺鹅去氧胆酸重量0.3倍的磷酸，滴加与甲醇相同体积的次氯酸钠水溶液，控温反应，反应过程温度不超过5℃；滴加完成后，采用液相检测TCDCA残留，若小于1%，则反应完成，加入无水亚硫酸钠搅拌20
‑
40min后，缓慢滴加水，过滤烘干，即得产物牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑
7K)。
[0010]其中，优选的，次氯酸钠水溶液的有效氯为12%。
[0011]其中，优选的，缓慢滴加与甲醇相同体积的水，过滤后置于真空干燥箱75℃干燥10h，即得产物牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑
7K)。
[0012]其中，优选的，第二步反应中，共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
‑
HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌中，编码7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
‑
HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。
[0013]其中，优选的，共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
‑
HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌通过以下方法构建得到：（1）将7β
‑
HSDH和GDH基因分别进行密码子优化，并进行全基因合成，编码7β
‑
HSDH和GDH的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；（2）将合成的两个基因各自依次连接入pETDuet1载体，得到共表达7β
‑
HSDH和GDH的重组质粒pETDuet1
‑
GDH
‑
7βHSDH；（3）将pETDuet1
‑
GDH
‑
7βHSDH转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到带有重组质粒的工程菌BL21(DE3)
‑
pETDuet1
‑
GDH
‑
7β
‑
HSDH；（4）工程菌的培养，将工程菌接种到培养基中进行培养，得到共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
‑
HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌。
[0014]其中，优选的，步骤（4）中，所述的工程菌的培养包括以下步骤：（1）将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于37℃活化培养16~20h，从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有100mg/L氨苄青霉素(Amp
+ ) LB液体培养基的三角瓶中，在200rpm/min、37℃下震荡培养16~20h；（2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，包括：第一步：牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）通过化学氧化反应制备得到牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑
7K)；第二步：将第一步制备得到的牛磺7
‑
酮石胆酸(T
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7K)通过共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
‑
HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞催化还原生产得到牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步反应包括如下步骤：取牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA），按照1g牛磺鹅去氧胆酸加入1ml甲醇的量加入甲醇，溶解后，加入牛磺鹅去氧胆酸重量0.3倍的磷酸，滴加与甲醇相同体积的次氯酸钠水溶液，控温反应，反应过程温度不超过5℃；滴加完成后，采用液相检测TCDCA残留，若小于1%，则反应完成，加入无水亚硫酸钠搅拌20
‑
40min后，缓慢滴加水，过滤烘干，即得产物牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑
7K)。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，次氯酸钠水溶液的有效氯为12%。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，缓慢滴加与甲醇相同体积的水，过滤后置于真空干燥箱75℃干燥10h，即得产物牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑
7K)。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二步反应中，共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
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HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌中，编码7β
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羟基类固醇脱氢酶（7β
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HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
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HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌通过以下方法构建得到：（1）将7β
‑
HSDH和GDH基因分别进行密码子优化，并进行全基因合成，编码7β
‑
HSDH和GDH的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；（2）将合成的两个基因各自依次连接入pETDuet1载体，得到共表达7β
‑
HSDH和GDH的重组质粒pETDuet1
‑
GDH
‑
7βHSDH；（3）将pETDuet1
‑
GDH
‑
7βHSDH转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到带有重组质粒的工程菌BL21(DE3)
‑
pETDuet1
‑
GDH
‑
7β
‑
HSDH；（4）工程菌的培养，将工程菌接种到培养基中进行培养，得到共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β
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HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的工程菌的培养包括以下步骤：（1）将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于37℃活化培养16~20h，从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有100mg/L氨苄青霉素(Amp
+ ) LB液体培养基的三角瓶中，在200rpm/min、37℃下震荡培养16~20h；（2）将步骤（1）的培养物按1:100比例转接到含有100mg/L氨苄青霉素(Amp
+ ) 的TB液体培养基，在200rpm/min、37℃下震荡培养4~6h，加入0.4mM的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代吡喃半乳糖苷(IPTG )，25℃下继续培养10~16h，得到共表达7β
‑
羟基类固醇脱氢酶（7β

【专利技术属性】
技术研发人员：张天，王力，边朝阳，薛童，朱丽惠，
申请(专利权)人：北京岳达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：