三环二萜类化合物的C-14和C-12位羟化酶制造技术

本发明专利技术涉及一种酶，所述酶具有催化松香烷型三环二萜化合物的C

【技术实现步骤摘要】
三环二萜类化合物的C
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14和C
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12位羟化酶


[0001]本专利技术涉及一种雷公藤细胞色素P450氧化酶，以及编码所述酶的多核苷酸，所述酶可用于松香烷型三环二萜类化合物的关键碳
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14位(C
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14)、碳
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12位(C
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12)位生物合成，属于药用植物基因工程领域。

技术介绍

[0002]雷公藤甲素是药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的主要活性成分之一，是一种具有3个环氧基团及一个α,β不饱和五元内酯环结构的松香烷型二萜化合物，同时也是雷公藤中活性最高的环氧二萜内酯化合物(Zhou ZL,et al.Triptolide:structural modifications,structure
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activity relationships,bioactivities,clinical development and mechanisms[J].Nat.Prod.Rep.2012,29)。雷公藤甲素具有显著的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等生物活性，对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫系统疾病，胰腺癌、肺癌等多种癌症具有较好的疗效，同时研究表明，雷公藤甲素对老年痴呆症、帕金森病等中枢神经系统疾病展现出潜在的药用价值，基于雷公藤甲素构效机制研发的多种衍生药物已进入临床试验阶段(Zhou ZL,et al.Triptolide:structural modifications,structure
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activity relationships,bioactivities,clinical development and mechanisms.Nat.Prod.Rep.,2012,29；TitovDV,et al.XPB,a subunit of TFIIH,is a target of the natural product triptolide.Nat.Chem.Biol,2011,7)。当前，雷公藤甲素的获取方式依赖传统的植物提取和化学合成，受限于植物较长的生长周期和化合物复杂的手性结构，其获取量难以满足临床科研和治疗的大量需求。近年来，利用合成生物学策略对雷公藤甲素生物合成途径进行解析，有望通过这种新颖且可持续的生产方式获取雷公藤甲素及其中间体。
[0003]当前，雷公藤甲素生物合成途径的解析，已成功表征了萜类合酶TPS7v2和TPS27v2环化形成雷公藤甲素关键母核结构——次丹参酮二烯(Su P,et al.Identification and functional characterization of diterpene synthases for triptolide biosynthesis from Tripterygium wilfordii.Plant J.,2018,93)，并揭示了其生物合成下游途径第一个细胞色素P450 CYP728B70基因(Tu L,et al.Genome of Tripterygium wilfordii and identification of cytochrome P450 involved in triptolide biosynthesis.Nat.Commun.,2020,11)，完成了从二萜共同前体GGPP到次丹参酮二烯的母核环化，再经双键重排自发转化为阿松香三烯，最后到脱氢松香酸的羧基化过程。然而，参与从脱氢松香酸到雷公藤甲素的多个位点的羟化酶未被发掘。由此可见，揭示雷公藤甲素的羟基化机制对雷公藤甲素的生物合成及结构修饰具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一方面，提供了一种分离的酶，所述酶参与三环二萜类化合物的C
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14和C
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12位羟基化过程，尤其是松香烷型二萜类化合物的C
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14和C
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12位羟基化过程，本专利技术
所述酶，还可催化松香烷型三环二萜类化合物的C环芳香化。
[0005]本专利技术中，所述分离的酶，是从药用植物雷公藤中分离得到的细胞色素p450氧化酶(以下用CYP82D263表示)，参与雷公藤松香烷型二萜类化合物C
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14和C
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12位羟化的合成过程，以及C环芳香化，尤其是雷公藤甲素C
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14和C
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12位羟化的关键酶，所述酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸其功能相同的肽。
[0006]可以在CYP82D263酶中进行氨基酸序列改变以便最少破坏对生物学活性必须的高级结构。例如，当CYP82D263酶包含一个或多个螺旋时，将改变氨基酸残基以便不破坏螺旋的几何学和其中的构象改变将使一些关键功能(例如分子与其结合伙伴的结合)减弱的其它分子成分。氨基酸序列改变的效果可以通过例如以上公开的计算机模拟进行预测，或通过晶体结构分析进行测定(例如Lapthorn等，Nat.Struct.Biol.2:266
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268,1995)。本领域熟知的其它技术对改变蛋白和标准分子(例如天然蛋白)的折叠进行比较，例如，可以比较变体和标准分子中的半胱氨酸分布情况。质谱和使用还原烷基化的化学修饰为测定与二硫键相关的或未形成这些键的半胱氨酸残基提供了方法(Bean,et al.Anal.Biochem.1992,201:216
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266；Gray,Protein Sci.1993,2:1732
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1748；Patterson,et al.Anal.Chem.1994,66:3727
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3732)。一般认为如果修饰的分子与标准分子具有不相同的半胱氨酸分布情况，则折叠受到影响。另一个用于测量这点的被接受的熟知方法是园二色谱(CD)。测量和比较修饰分子和标准分子产生的CD谱是常规的(Johnson,Proteins.1990,7:205
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214)。晶体学是另一个分析折叠和结构的熟知方法，核磁共振(NMR)、消化肽作图和表位作图也是分析折叠及蛋白质和多肽之间的结构相似性的已知方法(Schaanan,et al.Science.1992,257:961
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964)。
[0007]本专利技术中，CYP82D263酶的变异体形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与CYP82D263酶编码基因杂交的DNA所编码的蛋白。
[0008]本专利技术的第二方面，提供了一种编码本专利技术所述酶的多核苷酸(或称雷公藤细胞色素P450氧化酶编码基因，以下可用CYP82D263表示)，所述多核苷酸优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列指位于SEQ ID NO：1序列核苷酸中，有一个或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列酶在催化松香烷型三环二萜类化合物C
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12和C
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14位羟基化，以及催化C环芳香化方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其中所述催化松香烷型三环二萜类化合物C
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12和C
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14位羟基化，所生成的产物为包含C
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12位羟基化的单一位点羟化产物和C
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14位羟基化的单一位点羟化产物，但不包含C
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12位和C
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14位同时羟基化的双羟化产物。3.根据权利要求2所述的应用，其中编码所述酶的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。4.包含权利要求3所述多核苷酸的表达载体，其含有启动子和转录终止子，其中所述启动子与所述多核苷酸可操作地连接，并且所示多核苷酸与所述转录终止子可操作地连接，所述多核苷酸可用于催化三环二萜类化合物C
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12和C
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14位羟基化、以及催化C环芳香化。5.包含权利要求3所述多核苷酸、或权利要求4所述表达载体的重组宿主菌，所述宿主菌为酵母菌，如BY系酵母菌、WAT系酵母菌，所述重组酵母菌具有催化三环二萜类化合物C
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12和C
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14位羟基化、以及催化C环芳香化。6.权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：高伟，张逸风，高杰，马林，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京世纪坛医院，
类型：发明
国别省市：