草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建及其在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建及其在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用。本发明专利技术通过构建含有编码β

【技术实现步骤摘要】
草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建及其在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用


[0001]本专利技术涉及鱼类生物
，具体涉及一种草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建及其在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用。

技术介绍

[0002]糖类是鱼类配合饲料中一类重要的廉价能源物质，适当添加糖类物质不但可以降低饲料成本，而且可以减少蛋白质的消耗，以及有利于氨基酸的活化并促进鱼类的生长。但是，与哺乳动物不同，鱼类对糖的利用能力较低，常表现为“葡萄糖耐受不良”，这就限制糖类在鱼类饲料中的使用。改善鱼类对糖类的利用能力有利于降低饲料成本和增加鱼类生产性能。动物机体中存在部分基因可以调控机体对饲料中糖类物质的消化、吸收和代谢的能力。肝脏是鱼类代谢反应中枢，并且是鱼类代谢葡萄糖的主要场所，鱼类肝脏内存在大量的糖代谢酶，如葡萄糖转运蛋白：钠/葡萄糖转运蛋白1(SGLT1)；糖酵解途径中的关键酶：葡萄糖激酶(GK)，丙酮酸激酶(PK)；糖异生途径中的主要酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)。糖酵解途径是鱼体所有组织器官进行葡萄糖分解的唯一途径，而糖异生途径涉及到非糖底物催化合成葡萄糖的过程，调控这两个途径对于肝脏对糖类的利用具有非常重要的作用。
[0003]作为一种胞内蛋白，β
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catenin被认为是经典Wnt/β
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catenin信号通路的核心蛋白，也是该通路的效应器，Wnt/β
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catenin信号通路发挥作用依赖于β
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catenin在细胞核中的积聚。β
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catenin主要负责将Wnt信号从细胞质传导到细胞核内，作为转录共激活子与T细胞特异性转录因子/淋巴增强因子结合以此来调控该信号通路下游目的基因的表达。β
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catenin在进化上是非常保守的，不同物种的β
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catenin的相似度非常高。β
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catenin参与调节细胞周期、凋亡、增殖、分化、代谢、氧化应激等多种生物学过程。同时，β
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catenin在肝脏的生长、发育、再生、代谢等方面发挥着重要作用，在肝脏的生命活动中扮演着重要的角色。
[0004]综上所述，鱼类肝脏对于糖类代谢具有非常重要的作用，且β
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catenin表达量和活性的改变会影响肝脏代谢。此外饲料中的多种成份对β
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catenin的表达量和活性具有非常显著的影响。研究β
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catenin在肝细胞中的分子作用对促进肝脏糖类利用、降低饲料成本十分重要。因此，构建稳定过表达β
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catenin的草鱼肝细胞系对于研究β
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catenin调控肝脏细胞对糖的利用具有非常重要的意义，并为提高鱼类肝脏对糖的利用能力提供一个重要的靶标。
[0005]目前，尚未见到关于通过慢病毒感染构建稳定过表达细胞系及通过提高β
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catenin水平来提高肝脏细胞对糖类的利用能力应用在经济鱼类中的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建及其在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用；本专利技术以高效便捷地实现ctnnb1基因在草鱼肝细胞系L8824中的稳定过表达，从而提高草鱼肝细胞系对糖的利用能力，为提高
鱼类肝脏对糖的利用能力提供了非常有效的靶标。同时，活体葡萄糖注射实验结果显示草鱼肝脏中ctnnb1基因水平与糖酵解途径中的关键基因
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gk和糖异生途径中的关键基因
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pepeck表达水平显著相关，接着从蛋白水平再次验证肝脏中β
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catenin水平与肝脏利用糖的能力存在相关性。表明β
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catenin蛋白水平与草鱼肝脏利用糖的能力具有相关性，也表明测定β
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catenin的蛋白水平还可判断鱼类肝脏对糖的利用能力。此外，本专利技术也为过表达慢病毒应用在其它经济鱼类细胞系中提供指导。
[0007]为实现上述目的，本专利技术设计一种草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0008]1)ctnnb1基因过表达慢病毒载体的构建
[0009]a.以草鱼全长cDNA为模板，采用下述ctnnb1 PCR扩增引物，通过PCR反应，扩增获得ctnnb1 PCR产物；其中，PCR扩增引物ctnnb1如下：
[0010]ctnnb1上游引物：
[0011]atagaagacaccgactctagaatggctacccaatctgacttgatg(如SEQ ID NO:1所示)；
[0012]ctnnb1下游引物：
[0013]ctcaccatggtggcgaccggtcagatcggtatcaaaccaggc(如SEQ ID NO:2所示)；
[0014]b.pLV
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eGFP慢病毒表达载体通过限制性内切酶为XbaⅠ和AgeⅠ进行双酶切，得到线性化的pLV
‑
eGFP慢病毒表达载体；
[0015]c.将ctnnb1 cDNA PCR产物与线性化的pLV
‑
eGFP慢病毒表达载体进行重组，将得到的重组产物转化进新鲜的感受态大肠杆菌细胞，即得到含目的基因的pLV
‑
eGFP
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ctnnb1慢病毒载体；
[0016]2)草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建
[0017]将上述pLV
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eGFP
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ctnnb1慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pSPAX2质粒和pMD2.G质粒同时共转染入人胚胎肾细胞HEK293T细胞中，在该细胞中进行病毒的包装，包装好的病毒会被分泌到细胞外的培养基中，收集培养基，将培养基离心后取得上清液，上清液经过过滤、离心浓缩后即为草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒。
[0018]进一步地，所述步骤2)中，pLV
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eGFP
‑
ctnnb1慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pSPAX2质粒和pMD2.G质粒的质量比为4:3：1。
[0019]本专利技术还提供了一种上述方法构建的草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用。
[0020]进一步地，所述鱼类为草鱼。
[0021]本专利技术还提供了一种能够稳定过表达ctnnb1基因的重组细胞系命名为L8824
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β
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catenin，所述重组草鱼肝细胞系L8824
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β
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catenin中含有能够稳定过表达草鱼ctnnb1基因(ctnnb1基因编码的外源β
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catenin蛋白在此细胞系中表达稳定)；所述ctnnb1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)ctnnb1基因过表达慢病毒载体的构建a.以草鱼全长cDNA为模板，采用下述ctnnb1 PCR扩增引物，通过PCR反应，扩增获得ctnnb1 CDS PCR产物；其中，PCR扩增ctnnb1引物如下：ctnnb1上游引物：atagaagacaccgactctagaatggctacccaatctgacttgatg；ctnnb1下游引物：ctcaccatggtggcgaccggtcagatcggtatcaaaccaggc；b.pLV
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eGFP慢病毒表达载体通过限制性内切酶为Xba
ꢀⅠ
和Age
ꢀⅠ
进行双酶切，得到线性化的pLV
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eGFP慢病毒表达载体；c.将ctnnb1 PCR产物与线性化的pLV
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eGFP慢病毒表达载体进行重组，将得到的重组产物转化进新鲜的感受态大肠杆菌细胞，即得到含目的基因的pLV
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eGFP
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ctnnb1慢病毒载体；2)草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建将上述pLV
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eGFP
‑
ctnnb1慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pSPAX2质粒和pMD2.G质粒同时共转染入人胚胎肾细胞HEK293T细胞中，在该细胞中进行病毒的包装，包装好的病毒会被分泌到细胞外的培养基中，收集培养基，将培养基离心后取得上清液，上清液经过过滤、离心浓缩后即为草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒。2.根据权利要求1所述草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中，pLV
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eGFP
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ctnnb1慢病毒载体、慢病毒包装辅助载体pSP...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗智，徐一闯，谭肖英，赵涛，魏晓雷，宋玉峰，郑华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：