一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法技术

本申请涉及间充质干细胞培养领域，具体公开了一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法。永生化间充质干细胞的构建方法包括：基因合成；构建重组慢病毒质粒；慢病毒包装；利用慢病毒转染间充质干细胞，即得永生化间充质干细胞。制备外泌体的方法包括：永生化间充质干细胞培养；分离纯化：收集上清液，离心，去除细胞碎片，收集上清液，过滤；再次离心，弃上清液，重悬外泌体沉淀，得外泌体重悬液；将外泌体重悬液离心，弃上清液，即得外泌体。本申请的永生化间充质干细胞的构建方法能够构建出永生化并且大量分泌外泌体的间充质干细胞，不需要大规模的培养细胞就能够获得大量的外泌体，一定程度上可降低细胞培养成本。一定程度上可降低细胞培养成本。一定程度上可降低细胞培养成本。

【技术实现步骤摘要】
一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法


[0001]本申请涉及间充质干细胞培养领域，更具体地说，它涉及一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法。

技术介绍

[0002]外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，其广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞
‑
细胞间传递系统；不仅影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关，也可作为癌症疫苗和抗癌药物的载体、细胞治疗的潜在替代物。
[0003]在再生治疗应用中，外泌体可以避免干细胞治疗的一些缺陷，如伦理问题等，而且外泌体分离简单、稳定性高、储存方便，可以精确定量和分析，可作为干细胞治疗的有效替代物。与间充质干细胞本身相比，外泌体免疫原性低、无致瘤风险，具有较高的安全性和更大的组织再生潜能，因此，间充质干细胞外泌体在组织再生中具有极大的优势。
[0004]但是，间充质干细胞的体外扩增能力不足，经过几次穿传代之后细胞就开始衰老，衰老的间充质干细胞所分泌的外泌体再生能力明显受损，治疗效果也大打折扣。因此，为了获得足够量且具备再生潜能的外泌体用于治疗，相关企业选择扩大间充质细胞的培养规模、不断重复的制备间充质细胞。
[0005]针对上述中的相关技术，专利技术人认为扩大培养规模的方式虽然可以制备大量的间充质干细胞外泌体，但这种扩大细胞培养规模的方式无疑会增加细胞培养的成本，同时还会增加大量劳动力。

技术实现思路

[0006]为了解决需要大规模培养间充质干细胞才能制备大量的外泌体的问题，本申请提供一种永生化间充质干细胞的构建方法及制备外泌体的方法。
[0007]第一方面，本申请提供一种永生化间充质干细胞的构建方法，采用如下的技术方案：一种永生化间充质干细胞的构建方法，包括以下步骤：S1、基因合成：利用P2A序列连接c
‑
Myc序列和CD9序列，合成Myc
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P2A
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CD9基因片段；S2、构建重组慢病毒质粒：将Myc
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P2A
‑
CD9基因片段连接至pLV
‑
Flag（C1）质粒；S3、慢病毒包装：利用S2中的重组慢病毒质粒转染293T细胞，收集慢病毒；S4、构建永生化间充质干细胞：利用S3中的慢病毒转染间充质干细胞，即得永生化间充质干细胞。
[0008]通过采用上述技术方案，c
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Myc是最早发现的原癌基因，有许多与瘤化相关的功能区域，其转录表达的蛋白通过核膜进入细胞核与端粒酶的启动子结合位点特异性结合，诱导端粒酶mRNA快速表达，直接激活端粒酶活性，促进细胞进入永生化；CD9具有多种生物学
功能，其在细胞黏附、细胞运动、激活、分化、肿瘤转移等方面发挥着重要的作用，也能够促进细胞分泌外泌体；P2A作为自我剪切肽，能够使一条转录产物产生多种蛋白。传统的将多个基因同时表达的技术方案是利用多个启动子和开放阅读框，多个启动子会导致载体显著增大，可能会导致后续的转染效率低；多个启动子还易给宿主细胞带来代谢负担。P2A的大小只有60bp，在连接c
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Myc基因和CD9基因时，不会明显增加载体的长度，可降低多启动子带来的宿主细胞代谢负担，可增强后续的细胞转染效率。
[0009]本技术方案利用P2A连接c
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Myc基因和CD9基因，构建出重组慢病毒质粒，再用重组慢病毒质粒包装出重组慢病毒，利用重组慢病毒感染间充质干细胞，从而在蛋白质翻译后，P2A经过剪切获得的c
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Myc和CD9这两种蛋白可分别行驶功能。在c
‑
Myc的作用下使得间充质干细胞进入永生化，在CD9的作用下使得间充质干细胞能够大量分泌外泌体，进而获得可无限次传代且能够大量分泌外泌体的永生化间充质干细胞，不需要大规模的培养细胞就能够获得大量的外泌体，一定程度上可降低细胞培养成本。
[0010]优选的，所述步骤S2中采用以下方法进行连接：1）酶切：对Myc
‑
P2A
‑
CD9基因片段进行酶切得到目的基因片段，对pLV
‑
Flag（C1）质粒进行线性化酶切得到线性化质粒；2）回收目的基因片段和线性化质粒；3）连接：将9.5
‑
10.5μL连接试剂、2.3
‑
2.7μL线性化质粒和7.3
‑
7.7μL目的基因片段混匀，于16℃反应28
‑
32min，得含有重组慢病毒质粒pLV
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MYC
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P2A
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CD9的连接产物；4）转化：利用3）中的连接产物转化DH5α感受态细胞，并进行质粒抽提，得到重组慢病毒质粒pLV
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MYC
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P2A
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CD9。
[0011]通过采用上述技术方案，利用特定用量的连接试剂、线性化质粒和目的基因片段，使得线性化质粒和目的基因片段能够更好的连接，再经过转化和质粒抽提，从而可准确的构建出重组慢病毒质粒。
[0012]优选的，所述酶切具体采用以下方法进行：Myc
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P2A
‑
CD9基因片段酶切：取0.8
‑
1.2μg Myc
‑
P2A
‑
CD9基因片段、加入0.8
‑
1.2μL限制性内切酶Xba I、0.8
‑
1.2μL限制性内切酶EcoR I和4.8
‑
5.2μL缓冲液，加入双蒸水至总体积为50μL，置于37℃反应55
‑
65min，得A样品；pLV
‑
Flag（C1）质粒线性化酶切：取0.8
‑
1.2μg pLV
‑
Flag（C1）质粒，加入0.8
‑
1.2μL限制性内切酶Xba I、0.8
‑
1.2μL限制性内切酶EcoR I和4.8
‑
5.2μL缓冲液，加入双蒸水至总体积为50μL，置于37℃反应55
‑
65min，得B样品。
[0013]通过采用上述技术方案，利用限制性内切酶Xba I和限制性内切酶EcoR I分别对Myc
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P2A
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CD9基因片段和pLV
‑
Flag（C1）质粒进行酶切，从而得到所需的目的基因片段和线性化质粒。
[0014]优选的，所述目的基因片段和线性化质粒采用以下方法将进行回收：1）制备琼脂糖凝胶；2）琼脂糖凝胶电泳：取A样品和B样品分别与5倍浓缩的DNA上样缓冲液混合，至DNA上样缓冲液终浓度为一倍浓缩后，将混合液加入琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压下电泳28
‑
32min；
3）目的条带切胶：切下含目的条带的琼脂糖凝胶并转移到离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种永生化间充质干细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、基因合成：利用P2A序列连接c
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Myc序列和CD9序列，合成Myc
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P2A
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CD9基因片段；S2、构建重组慢病毒质粒：将Myc
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P2A
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CD9基因片段连接至pLV
‑
Flag（C1）质粒；S3、慢病毒包装：利用S2中的重组慢病毒质粒转染293T细胞，收集慢病毒；S4、构建永生化间充质干细胞：利用S3中的慢病毒转染间充质干细胞，即得永生化间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的一种永生化间充质干细胞的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中采用以下方法进行连接：1）酶切：对Myc
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P2A
‑
CD9基因片段进行酶切得到目的基因片段，对pLV
‑
Flag（C1）质粒进行线性化酶切得到线性化质粒；2）回收目的基因片段和线性化质粒；3）连接：将9.5
‑
10.5μL连接试剂、2.3
‑
2.7μL线性化质粒和7.3
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7.7μL目的基因片段混匀，于16℃反应28
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32min，得含有重组慢病毒质粒pLV
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MYC
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P2A
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CD9的连接产物；4）转化：利用3）中的连接产物转化DH5α感受态细胞，并进行质粒抽提，得到重组慢病毒质粒pLV
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MYC
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P2A
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CD9。3.根据权利要求2所述的一种永生化间充质干细胞的构建方法，其特征在于：所述酶切具体采用以下方法进行：Myc
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P2A
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CD9基因片段酶切：取0.8
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1.2μg Myc
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P2A
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CD9基因片段、加入0.8
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1.2μL限制性内切酶Xba I、0.8
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1.2μL限制性内切酶EcoR I和4.8
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5.2μL缓冲液，加入双蒸水至总体积为50μL，置于37℃反应55
‑
65min，得A样品；pLV
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Flag（C1）质粒线性化酶切：取0.8
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1.2μg pLV
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Flag（C1）质粒，加入0.8
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1.2μL限制性内切酶Xba I、0.8
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1.2μL限制性内切酶EcoR I和4.8
‑
5.2μL缓冲液，加入双蒸水至总体积为50μL，置于37℃反应55
‑
65min，得B样品。4.根据权利要求3所述的一种永生化间充质干细胞的构建方法，其特征在于：所述目的基因片段和线性化质粒采用以下方法将进行回收：1）制备琼脂糖凝胶；2）琼脂糖凝胶电泳：取A样品和B样品分别与5倍浓缩的DNA上样缓冲液混合，至DNA上样缓冲液终浓度为一倍浓缩后，将混合液加入琼脂糖凝胶点样孔中，120V电压下电泳28
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32min ；3）目的条带切胶：切下含目的条带的琼脂糖凝胶并转移到离心管中，再进行回收目的基因片段和线性化质粒。5.根据权利要求2所述的一种永生化间...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏玉龙，吴炯，
申请(专利权)人：苏州恒康生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：