一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法技术

本发明专利技术属于品种纯度检测技术领域，具体公开了一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法，大大减少了提取亲本基因组DNA的数量，所采取的混合取样后提取总基因组DNA的方法相比较单株提取方法节约了80％以上DNA提取的工作量，也大大减少了进行PCR扩增和凝胶电泳的次数，节约了80％以上的时间、试剂耗材和人力，大大提高了工作效率。大大提高了工作效率。大大提高了工作效率。

【技术实现步骤摘要】
一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法


[0001]本专利技术属于品种纯度检测
，尤其涉及一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法。

技术介绍

[0002]纯度是农作物种子质量的重要指标，对农作物产量及品质具有直接影响。杂交水稻、玉米等亲本的一致性、稳定性和特异性是培育杂交组合的遗传基础，在杂交制种过程中，亲本的纯度直接影响到杂交种子的纯度；
[0003]目前种子纯度鉴定方法主要分为田间小区种植鉴定和室内SSR分子标记鉴定。田间小区种植方法是国家标准规定的方法，也是公认的最可靠方法，但是其鉴定费用较高，周期较长，受季节限制，鉴定结果常常滞后于种子销售，如果在纯度不知情的情况下进行制种，则会造成因不育系纯度低带来的制种纯度不合格，给种业企业制种带来很大风险；室内SSR分子标记鉴定具有快速、稳定、准确且不受环境因素影响等特点，非常适用于大规模的种子纯度鉴定，也是目前室内鉴定杂交水稻种子纯度应用最广泛的方法，也是种子企业鉴定种子纯度的优选方法，在亲本完全纯合前提下，有望成为田间小区种植鉴定的替代技术。但是亲本种子纯度要求较高，粮食作物种子质量标准要求水稻、玉米等亲本纯度不低于99.6％，就目前的种业生产情况，因从业人员和专业技术人员的减少，去杂工作的要求越来越高，需要对亲本的纯度提出更高的要求。
[0004]当前SSR及其他分子标记是对单株或单粒种子进行鉴定，以水稻为例，建立在1000株单株样本上的一致性判定，对于分子标记检测来说，其工作量和成本都是很大的，检测效率较低。因此，亟需建立一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法，以解决当前品种亲本纯度和一致性分子检测所存在的工作量大、效率低和成本高等问题。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术的首要目的在于提供一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法。
[0006]本专利技术的具体技术方案包括：
[0007]本专利技术提供了一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法，包括以下步骤：
[0008](1)将待鉴定的禾本科作物杂交种子亲本进行发苗或种植于田间；
[0009](2)当苗长到两叶一心时，对所得苗进行编号并分组；
[0010](3)剪取每组中各个苗的叶片组织并混合，得到各组混合样品，分别提取各组所述混合样品的总基因组DNA；
[0011](4)分别以各组所述混合样品的总基因组DNA为模板，选用SSR引物进行PCR扩增，得到各组的扩增产物，分别对各组扩增产物进行凝胶电泳处理，记录各组样品的DNA特征谱带，当某组扩增产物的DNA特征谱带存在3个以上位点差异，则将该组确定为异样；
[0012](5)将步骤(4)确定为异样的组中的各个苗进一步编号并分组；
[0013](6)重复上述步骤(3)
‑
(5)直至确定杂株。
[0014]作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(1)中，禾本科作物杂交种子亲本发苗时置于96孔PCR板或96孔深孔板中，发苗数量或田间种植数量不少于1000株。
[0015]作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(2)中，当禾本科作物杂交种子亲本发苗数量或田间种植数量为1000株时，所得苗按照m
×
n的分组方式进行，m
×
n为1
×
1000、10
×
100、20
×
50、40
×
25、50
×
20、100
×
10或125
×
8中的任意一种，其中，m是一组混合提取基因组总DNA一组的株数，n是提取基因组总DNA次数。
[0016]作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(2)中，当禾本科作物杂交种子亲本发苗数量或田间种植数量为1000株时，所得苗的分组方式为50
×
20。
[0017]作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(4)凝胶电泳处理步骤具体为，分别将各组扩增产物在质量比为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，400V恒压电泳30min后，将凝胶放入固定液中固定8min，用双蒸水快速漂洗1次，然后在质量比为0.15％的AgNO3溶液中染色12min，用双蒸水快速漂洗2次，再将凝胶放入显色液中进行显色处理，至出现清晰条带后，用双蒸水漂洗2次，最后将凝胶置于终止液中处理5min，拍照记录样品DNA的特征谱带。
[0018]作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(4)选用的SSR引物为中华人民共和国农业行业标准NYT1433
‑
2014中水稻品种鉴定技术规程SSR标记法推荐的48对SSR引物或中华人民共和国农业行业标准NYT1432
‑
2014中玉米品种鉴定技术规程SSR标记法推荐的40对SSR引物或中华人民共和国农业行业标准NYT2470
‑
2013中小麦品种鉴定技术规程SSR标记法推荐的43对SSR引物。
[0019]作为本专利技术的进一步优化方案，所述步骤(4)选用的SSR引物为中华人民共和国农业行业标准NYT1433
‑
2014中水稻品种鉴定技术规程SSR标记法推荐的20对引物为RM583、RM274、RM336、RM219、RM209、RM1195、RM208、RM232、RM481、RM339、RM278、RM258、RM224、RM17、RM561、RM8277、RM551、RM21、RM423、RM7102。
[0020]作为本专利技术的进一步优化方案，所述禾本科作物适用于水稻、玉米和小麦。
[0021]综上所述，本专利技术的有益效果为：
[0022]本专利技术提出的针对禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法大大减少了提取亲本基因组DNA的数量，所采取的混合取样后提取总基因组DNA的方法相比较单株提取方法节约了80％以上DNA提取的工作量，也大大减少了进行PCR扩增和凝胶电泳的次数，节约了80％以上的时间、试剂耗材和人力，大大提高了工作效率。
附图说明
[0023]图1为实施例二中利用引物RM274、RM209、RM561、RM481、RM551、RM423、RM7102、RM8277检测本专利技术方法水稻总基因组DNA的特征条带的结果示意图，其中编号9为确定为异样的总基因组DNA。
具体实施方式
[0024]下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施
方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请做出一些非本质的改进和调整。
[0025]实施例一
[0026]一、材料
[0027]本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所有种子均由安徽荃银高科种业股份有限公司提供，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0028]二、方法
[0029]分五本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待鉴定的禾本科作物杂交种子亲本进行发苗或种植于田间；(2)当苗长到两叶一心时，对所得苗进行编号并分组；(3)剪取每组中各个苗的叶片组织并混合，得到各组混合样品，分别提取各组所述混合样品的总基因组DNA；(4)分别以各组所述混合样品的总基因组DNA为模板，选用SSR引物进行PCR扩增，得到各组的扩增产物，分别对各组扩增产物进行凝胶电泳处理，记录各组样品的DNA特征谱带，当某组扩增产物的DNA特征谱带存在3个以上位点差异，则将该组确定为异样；(5)将步骤(4)确定为异样的组中的各个苗进一步编号并分组；(6)重复上述步骤(3)
‑
(5)直至确定杂株。2.根据权利要求1所述的一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中，禾本科作物杂交种子亲本发苗时置于96孔PCR板或96孔深孔板中，发苗数量或田间种植数量不少于1000株。3.根据权利要求1所述的一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)中，当禾本科作物杂交种子亲本发苗数量或田间种植数量为1000株时，所得苗按照m
×
n分组方式进行，m
×
n为1
×
1000、10
×
100、20
×
50、40
×
25、50
×
20、100
×
10或125
×
8中的任意一种，其中，m是一组混合提取基因组总DNA一组的株数，n是提取基因组总DNA次数。4.根据权利要求3所述的一种禾本科作物杂交种子亲本纯度的快速鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)中，当禾本科作物杂交种子亲本发苗数量或田间种植数量为1000株时，所得苗的分组方...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，张从合，杨力，黄艳玲，方玉，管昌红，杨韦，陈思，吴浩然，严志，王林，周桂香，
申请(专利权)人：安徽荃银高科种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：