一种适用于分子标记辅助育种的DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于分子标记辅助育种的DNA提取方法，具体为：取植物样本置于容器内，再加入不锈钢钢珠和经预热处理的SDS提取液，研磨后离心，加入乙酸铵进行抽提，离心后取上清液；再在上清液中加入无水乙醇，混匀后离心，待沉淀干燥后再加入ddH2O重悬。该方法操作简单、成本低、安全无毒，适合大批量的DNA提取，而且能够满足分子标记辅助育种对DNA质量的要求。求。求。

A DNA extraction method suitable for molecular marker assisted breeding

【技术实现步骤摘要】
一种适用于分子标记辅助育种的DNA提取方法


[0001]本专利技术属于核酸提取
，具体涉及一种适用于分子标记辅助育种的 DNA提取方法。

技术介绍

[0002]玉米是世界上重要的粮饲作物之一，更是我国第一大粮食作物，玉米产量的提高在于选育优良品种。玉米育种的过程就是对控制重要性状的优良功能基因进行重组、聚合，选择优良基因型个体的过程，也即是选育优良种质的过程。
[0003]近年来，随着现代生物技术与分子生物学的快速发展，分子标记辅助育种在玉米育种中应用愈加广泛。分子标记辅助育种是一种利用与目的基因紧密连锁的分子标记对群体内不同个体的基因型进行选择，这种手段打破了传统的育种方式，能够精确、快速地改良目标性状进而选育出优良品种。构建合适的分离群体，并获得该分离群体的标记基因型和表现型是开展分子标记辅助育种的前提。故玉米基因组DNA的提取是分子标记辅助育种的基础和关键，尤其是适用于样本量大的分离群体的快速提取。
[0004]植物基因组DNA的提取可以分为裂解和纯化两大步骤，裂解是破坏样品细胞结构从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使DNA与裂解体系中的其他成分如蛋白质、盐及其他杂质彻底分离的过程。目前用于分子标记辅助育种的DNA提取方法通常存在以下问题：
①
裂解时需对待测样本进行液氮冷冻、研磨，耗费人力物力；
②
纯化过程中使用氯仿、异戊醇、苯酚、β
‑
巯基乙醇等有机溶剂，此类有机溶剂有较大的毒性，不仅对人体有害而且对环境有严重污染；
③
提取过程中需要多次水浴，且多次开盖操作会引起交叉污染；
④
采用的裂解液和抽提液(即纯化试剂)中均包含多种试剂，提取成本高。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种操作简单、成本低、安全无毒且适用于分子标记辅助育种的DNA提取方法。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]一种适用于分子标记辅助育种的DNA提取方法，包括以下步骤：
[0008]S1、取植物样本置于容器内，再加入不锈钢钢珠和经预热处理的SDS提取液，研磨后离心；
[0009]S2、加入乙酸铵进行抽提，然后离心后取上清液；
[0010]S3、在步骤S2所得上清液中加入无水乙醇，混匀后离心，弃液体，待沉淀干燥后再加入ddH2O重悬。
[0011]进一步地，在上述技术方案中，SDS提取液的组成为：200mmol/L Tris
‑
HCl， 1％SDS，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA；且SDS提取液的pH为8.0。
[0012]进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中乙酸铵浓度为7.5M，乙酸铵与SDS 提取液的体积比为1∶2。
[0013]进一步地，在上述技术方案中，植物样本具体为植物苗期叶片；更进一步地，叶片在经SDS提取液研磨处理前，先被初步破碎成较小的片状，具体可采用刀片或剪刀等剪碎，且最好采取不同方向破裂；在本专利技术的一些具体实施例中，植物为玉米。
[0014]进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中的预热处理具体为：将SDS提取液预先用65℃水浴处理。经水浴处理后的SDS提取液与植物样本组织接触研磨更充分，DNA产量更高。
[0015]进一步地，在上述技术方案中，步骤S2和步骤S3中的离心条件均为： 4000rpm下离心10min。
[0016]进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中干燥的温度为20～70℃，具体可采取自然晾干或烘箱干燥。
[0017]进一步地，在上述技术方案中，步骤S3中无水乙醇与上清液的体积比为2∶ 1，而且可在使用前对无水乙醇进行冷冻处理。
[0018]相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0019]1)省略了传统植物DNA提取方法中的液氮研磨、多次水浴提取等操作，并避免了复杂的提取试剂以及有毒抽提试剂(如氯仿、异戊醇)的使用，不仅降低了提取成本，且安全性高；
[0020]2)仅采用特定组分的SDS提取液提取植物中的基因组DNA，乙酸铵为DNA 提取过程提供缓冲环境，经乙醇一次沉淀即可得到质量能够满足分子标记辅助育种需求的DNA；故本专利技术的方法操作简单，提取效率高，适用于大规模DNA提取实验；
[0021]3)经本专利技术方法得到的DNA具有很好的稳定性，长时间放置后仍能满足分子标记辅助育种的DNA质量需求。
附图说明
[0022]图1为实施例1提取的玉米DNA用于分子标记umc1429y7纯度鉴定所得的电泳胶图；
[0023]图2为实施例1提取的玉米DNA用于分子标记umc1936k4纯度鉴定所得的电泳胶图；
[0024]图3为实施例1提取的玉米DNA用于分子标记SSR58抗病性鉴定所得的电泳胶图；
[0025]图4为实施例1提取的玉米DNA用于分子标记bnlg1006、nc130和phi024 检测8个标准测验种所得的电泳胶图
[0026]图5为实施例1提取的玉米DNA用于分子标记umc1239遗传多样性分析所得低电泳胶图；
[0027]图6为实施例1提取的玉米DNA用于分子标记Phi109275遗传多样性分析所得低电泳胶图；
[0028]图7为实施例2中的玉米DNA和对比例1提取的玉米DNA分别用于分子标记bnlg1716检测时的比较图。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0030]实施例1
[0031]将全玉1233(自育杂交品种)的种子和8个标准测验种(齐319、丹340、掖478、黄早
四、Mo17、B73、PH4CV和PH6WC)的种子于实验室内的培养箱中发芽，待玉米种子长出真叶时即采集叶片用于DNA提取。
[0032]DNA提取过程具体为：每个叶片均取1cm2大小，剪碎后置于96孔的深孔板中，每孔中各加入一颗不锈钢钢珠和400μL预先65℃水浴好的SDS提取液(含有200mmol/L Tris
‑
HCl，1％SDS，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA；pH为 8.0)，然后置于SPEX GENO 2010仪器内研磨1min，离心2min；再利用排枪在每孔中各加入200μL 7.5M乙酸铵充分混匀进行抽提，于4000rpm下离心2min；利用排枪吸取200μL上清液转移至另一96孔的深孔板中，每孔各加入400μL无水乙醇(提前
‑
20℃预冷)沉淀DNA，于4000rpm下离心2min；打开封板摸，倾倒96深孔板内全部液体，并在吸水纸上吸湿3次，然后倾斜放置在超净台上，直至DNA干燥，最后加入200μL的ddH2O，4℃备用。
[0033]实施例2
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于分子标记辅助育种的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取植物样本置于容器内，再加入不锈钢钢珠和经预热处理的SDS提取液，研磨后离心；S2、加入乙酸铵进行抽提，然后离心取上清液；S3、在上清液中加入无水乙醇，混匀后离心，弃液体，待沉淀干燥后再加入ddH2O重悬。2.根据权利要求1所述的DNA提取方法，其特征在于，所述SDS提取液包含：200mmol/L Tris
‑
HCl，1％SDS，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA；所述SDS提取液的pH为8.0。3.根据权利要求2所述的DNA提取方法，其特征在于，步骤S2所述乙酸铵的浓度为7.5M，所述乙酸铵与SDS提取液的体积比为1∶2。4.根据权利要求1所述的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：金锐，于新艳，朱全贵，苏法，李丹，邹志清，
申请(专利权)人：安徽荃银高科种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：