一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用，涉及活性肽技术领域。本发明专利技术采用三酶水解乳清蛋白制备高F值寡肽，首先用少量的碱性蛋白酶对其进行预处理，提高其溶解性并破坏其肽链，提高后续酶解的效率，然后依次采用内切蛋白酶处理和外切蛋白酶处理，最终以游离状态的形式存在于酶解液中，最终利用特异性树脂将芳香族氨基酸吸附，得到F值大于20的乳清蛋白肽，并最终分离筛选得到两条高F值寡肽。本发明专利技术所述乳清蛋白肽以及高F值寡肽可降低肝脏中丙二醛和甘油三酯的含量，升高还原型谷胱甘肽的含量，对化学性肝损伤有辅助保护作用。化学性肝损伤有辅助保护作用。化学性肝损伤有辅助保护作用。

【技术实现步骤摘要】
一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于活性肽
，具体涉及一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]F值(Fischer ratio)，是支链氨基酸(BCAA:Val，Ile，Leu)与芳香族氨基酸(AAA:Trp，Tyr，Phe)含量的摩尔数比值，为了纪念德国著名学者Fischer.J.E在20世纪70年代提出“伪神经递质假说”而命名。高F寡肽是利用蛋白酶作用于植物蛋白或动物蛋白后制得的支链氨基酸与芳香族氨基酸的摩尔数比值大于20，远高于人体中这两类氨基酸比值模式的一类生物活性肽。
[0003]高F值寡肽由于它具有独特的氨基酸组成和生理功能，已经受到食品和医药界的高度关注，且小分子肽相较于单体氨基酸具有渗透压低、抗原性低等优点，更容易被机体吸收，同时也具有诸多调节生理功能的功效。
[0004]虽然高F值寡肽具有非常广泛的生物活性，但是由于其产品的高标准，规模化生产非常不容易，如定向酶解工艺控制较差，重现性较差，以及芳香族氨基酸的去除效果差、效率低。因此亟需一种新的可满足工业化生产的高F值寡肽的制备方法。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一组具有肝损伤保护作用的乳清蛋白肽、高F值寡肽及其制备方法和应用，制备方法简单且可满足工业化要求，酶解定向性好，芳香族氨基酸去除效率高，且得到的乳清蛋白肽和高F值寡肽具有良好的肝损伤保护作用。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了乳清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行预处理后，然后利用内切蛋白酶将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，而后采用外切蛋白酶水解暴露的芳香族氨基酸，得酶解液；对酶解液进行离子交换柱层析，收集透过液，所述透过液中包括所述乳清蛋白肽。
[0008]优选的，所述预处理时，体系pH值为8.5，处理温度为52～55℃；
[0009]利用内切蛋白酶进行处理时，体系的pH值为7.0～7.5，处理温度为37～42℃。
[0010]优选的，所述预处理的时间为15～30min；
[0011]所述内切蛋白酶包括胰蛋白酶，酶解时间为2h；
[0012]所述外切蛋白酶包括风味蛋白酶，酶解时间为4h。
[0013]优选的，所述预处理时碱性蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的1/1000；
[0014]所述胰蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的13/1000；
[0015]所述风味蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的3/1000。
[0016]优选的，所述离子交换柱层析时，所述酶解液的添加流速为9ml/min。
[0017]优选的，所述酶解液经灭酶后进行离子交换柱层析；所述灭酶包括将酶解液加热至100℃保持10min。
[0018]优选的，在进行所述离子交换柱层析前，还包括对离子交换柱中的树脂进行预处理。
[0019]本专利技术还提供了利用上述制备方法制备得到的乳清蛋白肽，所述乳清蛋白肽的F值＞20。
[0020]本专利技术还提供了从上述乳清蛋白肽中分离筛选出的具有肝损伤保护作用的高F值寡肽。
[0021]优选的，所述高F值寡肽包括W1和W2，其中W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，W2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0022]本专利技术还提供了上述乳清蛋白肽或上述高F值寡肽在制备肝损伤保护药物或对肝损伤有辅助治疗作用的保健品中的应用。
[0023]有益效果：本专利技术提供了乳清蛋白肽的制备方法，适用于工业化生产，采用三酶水解乳清蛋白制备高F值寡肽，首先用少量的碱性蛋白酶对其进行预处理，提高其溶解性并破坏其肽链，提高后续酶解的效率，然后采用内切蛋白酶处理将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，然后采用外切蛋白酶将暴露的芳香族氨基酸从末端水解下来，最终以游离状态的形式存在于酶解液中，最终利用特异性树脂将芳香族氨基酸吸附，得到F值大于20的乳清蛋白肽，并最终分离筛选得到两条高F值寡肽。经实施例验证，所述乳清蛋白肽以及高F值寡肽高、中、低剂量组可降低肝脏中丙二醛和甘油三酯的含量，升高还原型谷胱甘肽的含量，并且各剂量组与模型对照组的肝细胞脂肪病变评分均存在显著性差异(P＜0.01)。根据《保健食品检验与评价技术规范》判定标准，高F值乳清蛋白肽对化学性肝损伤有辅助保护作用。
附图说明
[0024]图1为实施例1高F值乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
[0025]图2为实施例1乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
[0026]图3为实施例2乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
[0027]图4为实施例3乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
[0028]图5为实施例4乳清蛋白肽氨基酸分布结果图；
[0029]图6为制备型高效液相分离高F值乳清蛋白肽色谱图；
[0030]图7为W1的质谱图；
[0031]图8为W1的液相谱图；
[0032]图9为W2的质谱图；
[0033]图10为W2的液相谱图；
[0034]图11为斑马鱼酒精性肝损伤表型图，图中L：肝脏，Y：卵黄囊；黄色框线内为肝脏，红色框线内为卵黄囊。
具体实施方式
[0035]本专利技术提供了乳清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：利用碱性蛋白酶对乳清蛋
白进行预处理后，然后利用内切蛋白酶将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，而后采用外切蛋白酶水解暴露的芳香族氨基酸，得酶解液；对酶解液进行离子交换柱层析，收集透过液，所述透过液中包括所述乳清蛋白肽。
[0036]本专利技术利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行预处理，所述预处理包括在碱性条件下，利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行第一酶解，得第一酶解液。本专利技术所述第一酶解的体系pH值优选为8.5左右，第一酶解的温度优选为55℃。本专利技术在进行所述第一酶解时，优选将碱性蛋白酶和所述乳清蛋白按照1:1000的质量比混合后，于搅拌条件下进行第一酶解，得到第一酶解液，所述搅拌的转速优选为45rpm。本专利技术所述第一酶解的时间优选为15～30min。本专利技术所述预处理，可提高乳清蛋白的溶解性并破坏其肽链，提高后续酶解的效率。
[0037]本专利技术在所述预处理期间，优选还包括不断检测体系的pH值，待所述pH值下降至7.0～7.5时，同时温度下降至37～42℃，可添加内切蛋白酶，将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端。本专利技术所述内切蛋白酶优选包括胰蛋白酶，且所述胰蛋白酶的用量优选为所述乳清蛋白质量的13/1000。本专利技术利用所述胰蛋白酶对第一酶解液进行第二酶解，所述第二酶解的体系的pH值优选为7.0～7.5，处理温度优选为37～42℃，处理时间优选为2h，得第二酶解液。
[0038]本专利技术优选直接向所述第二酶解液中加入外切蛋白酶，进行第三酶解，从而将暴露的芳香族氨基酸从末端水解下来，最终以游离状态的形式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：利用碱性蛋白酶对乳清蛋白进行预处理后，然后利用内切蛋白酶将肽链的芳香族氨基酸暴露在C末端或N末端，而后采用外切蛋白酶水解暴露的芳香族氨基酸，得酶解液；对酶解液进行离子交换柱层析，收集透过液，所述透过液中包括所述乳清蛋白肽。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述预处理时，体系pH值为8.5，处理温度为52～55℃；利用内切蛋白酶进行处理时，体系的pH值为7.0～7.5，处理温度为37～42℃。3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述预处理的时间为15～30min；所述内切蛋白酶包括胰蛋白酶，酶解时间为2h；所述外切蛋白酶包括风味蛋白酶，酶解时间为3.5h～4h。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述预处理时碱性蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的1/1000；所述胰蛋白酶的质量为乳清蛋白质量的13/10...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴明辉，朱敏，支晓娜，冯小深，朱安琪，
申请(专利权)人：江苏祈瑞医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：