包含环状单链多核苷酸的核酸递送载体制造技术

本发明专利技术涉及用于递送单链核酸的递送载体。所述载体是包含至少三个部分的闭合环状多核苷酸，其中两个部分具有足够的互补性以形成双链体，以及含有待递送的单链核酸的间插序列。所述双链体包含靶向核酸酶的识别序列，使得在适当条件下释放单链核酸。适当条件下释放单链核酸。适当条件下释放单链核酸。

Nucleic acid delivery vector containing cyclic single stranded polynucleotides

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含环状单链多核苷酸的核酸递送载体
专利

[0001]本专利技术涉及单链核酸、特别是单链供体寡核苷酸的细胞内递送或释放。尽管此处考虑了任何类型的核酸，但可能优选的是单链脱氧核糖核酸(DNA)。
[0002]专利技术背景
[0003]最灵活的核酸区域通常是非碱基配对的，并且包括参与细胞内至关重要过程的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)和核糖核酸(ssRNA)区域。
[0004]例如，单链核酸分子对于将核酸递送至细胞的领域的技术人员来说是特别感兴趣的，因为核酸可立即在转染的细胞内供使用，并且不需要通过适当的酶“展开”以暴露ssDNA部分。然后这些部分可用于转录成ssRNA，例如信使RNA(mRNA)，或用于与识别ssDNA的其他蛋白相互作用。
[0005]单链DNA(ssDNA)是许多生物过程中必不可少的中间体，所述生物过程包括DNA的复制、重组、修复、转录和转座。因此，还希望将ssDNA引入细胞中，以便利用这些机制等产生治疗效果。ssDNA也可以有许多治疗用途。在真核细胞中，由于许多细胞过程(包括复制、转录和重组)，ssDNA经常暴露。暴露的ssDNA容易受到化学攻击和核酸降解；因此，必须对其进行适当的保护以避免突变。单链DNA结合蛋白(SSB)会立即与ssDNA结合，以保护其免受不适当的反应，直到相关过程完成。然而，没有受到如此保护的ssDNA容易受到化学攻击和核酸降解。
[0006]单链核酸分子对于将核酸递送至细胞的领域的技术人员来说是特别感兴趣的，因为核酸可立即在转染的细胞内供使用，并且不需要通过合适的酶“展开”以暴露相关的遗传信息(例如以用于转录和翻译或插入基因组)。它们被认为是多种应用，尤其是基因转移、基因编辑和生物传感的最佳递送载体。
[0007]或者，单链核酸可具有与其构象相关的功能，即作为适体或为核酸的酶(nucleic acid enzyme)(包括DNAzyme和RNAzyme)。
[0008]此外，在反义应用中可能需要在细胞中提供单链核酸。反义疗法涉及使用具有与靶序列如信使RNA(mRNA)互补的特定序列的寡核苷酸。
[0009]更进一步，为了翻译目的，可能需要在细胞中提供单链核酸，即提供mRNA以直接指导细胞内的蛋白生产。因此，单链核酸可以是RNA，特别是mRNA。其他类型的RNA也可以使用该载体递送，包括长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、重复相关siRNA、增强子RNA、反义RNA、引导RNA、小核仁RNA或小核RNA。
[0010]ssDNA和dsDNA供体序列都可以作为有效的基因编辑模板。已发现ssDNA供体模板在用于基因编辑时在修复特异性方面具有独特的优势(基于CRISPR的敲入的长ssDNA供体的设计和特异性；Han Li,Kyle A.Beckman,Veronica Pessino,Bo Huang,Jonathan S.Weissman,Manuel D.Leonetti bioRxiv 178905)，并且因此它们的使用是期望的。
[0011]尽管向细胞提供单链核酸是期望的，但这种方法可能存在一些缺点。核酸疗法的功效可能会受到不必要的降解的限制。已知化学修饰提高核酸稳定性，但是修饰的类型、位
置和数量都会有影响，并且在某些情况下可能期望最小化修饰的数量，因为使用修饰会影响核酸与蛋白结合的能力。
[0012]就其本质而言，单链核酸会在细胞内快速降解，因为游离的3'和5'末端可用于酶促降解，例如通过核酸酶(nuclease)的作用，该核酸酶“回嚼(chew back)”末端并破坏核酸。例如，哺乳动物细胞中主要的3'至5'DNA核酸外切酶Trex1优先作用于单链DNA(ssDNA)，并与单链DNA紧密(avidly)结合。人类TREX1基因的突变可导致Aicardi
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res综合征，其特征是免疫紊乱。已显示3'末端的核苷酸的修饰有助于抵抗此类降解。
[0013]多年来认为细胞溶质DNA具有免疫刺激作用，尤其是先天免疫系统。DNA通常存在于真核细胞的细胞核中，并且DNA在非典型位置(包括细胞质和内体)的存在被认为会触发免疫激活。细胞核以外任何地方的DNA的存在被认为会触发DNA识别系统来检测入侵病原体和不正确工作的细胞的DNA基因组。
[0014]已知在许多病原体的基因组中丰富的未甲基化CpG DNA基序能够刺激免疫反应。也已知具有特定标识(包括富含AT的茎环区域)的单链DNA激活免疫反应。
[0015]因此，希望以“隐蔽”方式递送单链核酸，即在先天免疫系统不易识别的载体中递送线性单链核酸，然后在细胞内释放线性单链核酸。
[0016]本专利技术人设计了一种递送载体，该载体使得能够在适当条件下释放单链核酸，例如在靶细胞的细胞核或其他区室中释放。可以递送单链核酸以用于其中需要线性单链核酸的任何可能的目的，例如作为供体用于基因编辑、用于细胞内翻译、用于修饰基因表达、用于提供实体如适体和为核酸的酶或用于反义应用。

技术实现思路

[0017]本专利技术涉及一种递送载体，其用于将线性单链核酸递送至细胞，优选靶细胞。递送载体实际上是其中放置单链核酸的载体或递送媒介物。细胞内的过程可以利用递送媒介物的结构并释放单链核酸。可以操作或设计构建体，使得单链核酸的释放仅在特定条件或特定细胞类型下发生。
[0018]用于线性单链核酸的递送载体的提供允许隐蔽递送如果不隐蔽递送会被快速降解的实体。可以控制或定向递送。
[0019]根据一个方面，本专利技术提供：
[0020]包含环状单链多核苷酸的核酸递送载体，所述载体包含：
[0021](a)由所述多核苷酸的第一部分和第三部分形成的双链体，所述部分包含互补的序列；
[0022](b)由第二部分形成的环，所述部分将所述第一和第三部分分开；
[0023]其中所述双链体包含靶向核酸酶的识别序列。
[0024]核酸递送载体被描述为单链多核苷酸，因为在变性条件下，递送载体是闭合环状多核苷酸。
[0025]递送载体优选递送线性单链核酸。所述单链核酸存在于递送载体的第二部分中，并且因此第二部分和线性单链核酸的序列基本相同。线性单链核酸可以采用任何合适的构象并且具有任何合适的序列。线性单链核酸可以是为核酸的酶、适体、供体模板或反义核酸，或本文讨论的任何单链核酸。一旦从递送载体中释放，线性单链核酸就具有游离的5'和
3'末端。取决于核酸酶的性质，单链核酸可以在第一和第三部分的片段仍然存在的情况下被释放。这就是诸如Cas9的核酸酶的情况，并且描绘于图1A和1B。这些片段的长度可能是小的，优选小于15个碱基。
[0026]靶向核酸酶可以是靶特异性的任何核酸酶。递送载体的双链体包含靶向核酸酶的识别位点。该核酸酶可以独立识别这个序列，或者它可能本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含环状单链多核苷酸的核酸递送载体，所述载体包含：(a)由所述多核苷酸的第一部分和第三部分形成的双链体，所述部分包含互补的序列；(b)由第二部分形成的环，所述部分将所述第一和第三部分分开；其中所述双链体包含靶向核酸酶的识别序列。2.根据权利要求1所述的核酸递送载体，其中所述载体递送线性单链核酸，其中所述单链核酸存在于所述第二部分内。3.根据权利要求2所述的核酸递送载体，其中所述线性单链核酸可以是以下中的任何一种或多种：为核酸的酶、适体、供体模板、mRNA、功能性RNA或反义核酸。4.根据权利要求2或3所述的核酸递送载体，其中所述线性单链核酸一旦从所述递送载体释放就具有游离的5'和3'末端。5.根据权利要求1所述的核酸递送载体，其中所述载体是闭合环状多...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：莱特碧奥有限公司，
类型：发明
国别省市：