一种重组III型胶原蛋白及其制备方法技术

本申请提供一种重组III型胶原蛋白及其制备方法和应用，本申请的重组III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、2、3所示。本申请的重组III型胶原蛋白与天然III型胶原蛋白相比，分子量确定，可在酵母等高等真核细胞中表达制备，具有好于天然胶原蛋白的良好生物活性，能有效促进细胞增殖和迁移；可广泛应用于食品、化妆品、保健品、药械等领域。本申请的制备方法具有生产过程条件温和，可高密度发酵生产，培养成本极低，周期短，蛋白表达量高，可规模化工业生产，表达系统可胞外分泌胶原蛋白，避免了菌体裂解带来的杂质蛋白，并且不含有内毒素等的优点。的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种重组III型胶原蛋白及其制备方法


[0001]本申请属于生物
，具体地，本申请涉及一种重组III型胶原蛋白及其制备方法。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一种生物高分子，它广泛存在于动物结缔组织中，约占体内蛋白总量的25%~30%，是哺乳动物体内分布最广、质量分数最多的功能性蛋白。因其具有良好的生物相容性、可生物降解性、低免疫原性以及生物活性（例如，可促进细胞增殖、分化、迁移，用于修复和止血），被广泛应用于化妆品、食品、医药、组织工程等领域。
[0003]目前主流的胶原蛋白制备方法包括动物源提取法和基因工程法两大类，动物源胶原蛋白的提取主要通过酸法和酶法进行产业化制备，成本相对更低，但存在动物源疾病感染、异源胶原蛋白可能导致免疫排斥或过敏反应、产能限制等问题。基因工程技术生产重组胶原蛋白组分单一、安全性高、生产过程可控。鉴于胶原蛋白具有广阔的应用前景，特别是在高端医用材料、保健品等领域对优质胶原蛋白的大量需求，利用基因工程技术重组表达胶原蛋白成为一个极具意义的研究方向。
[0004]基因工程涉及大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因作物等不同表达体系，哺乳动物细胞、昆虫细胞等表达体系成本高、周期长，难以满足产业化需求，相比之下，微生物发酵生产重组胶原蛋白成本低、周期短、培养较容易，更易于商业化生产。
[0005]细菌表达系统普遍存在诸如：产生的致热原致使表达产物难以应用于临床；目的蛋白以包涵体形式表达，致使产物纯化困难；原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等缺点，采用巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，可避免这些缺点，并能对翻译的蛋白质进行一定的翻译后修饰(包括二硫键形成和糖基化等)，有力支撑蛋白质生物学功能的实现。以巴氏毕赤酵母建立表达系统具有微生物表达系统可高密度发酵生产、培养成本低、蛋白表达水平高等规模化工业生产的优点，且其可分泌于胞外，避免了菌体裂解过程带来的杂质蛋白，同时，其细胞壁成分中不含内毒素、肽聚糖。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的上述问题，本申请利用基因工程技术重组表达一种新的III型胶原蛋白，其可避免病毒隐患以及排异反应，且分子量确定，生产过程条件温和，利于保持蛋白的生物活性。同时，本申请提供了该重组III型胶原蛋白的制备方法。
[0007]具体来说，本申请涉及以下方面：1.一种重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白为如下A1）
‑
A3）中的任一种：A1）SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；A2）将A1）所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或
添加得到的与所述重组III型胶原蛋白相关的蛋白质；A3）与A1）或A2）具有85％以上同一性且与所述重组III型胶原蛋白相关的蛋白质。
[0008]2. 一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码项1所述的重组III型胶原蛋白。
[0009]3. 根据项2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为如下C1）或C2）中的任一种：C1）核苷酸序列为SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6的DNA分子；C2）将SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列经过修饰和/或一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1）所示的DNA分子具有85％以上的同一性，且具有相同功能的DNA分子。
[0010]4. 一种载体，其中，所述载体包含项3所述的核酸分子。
[0011]5. 一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含项1所述的胶原蛋白或项2所述的核酸分子或项4所述的载体。
[0012]6. 根据项5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
[0013]7. 根据项6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为毕赤酵母。
[0014]8. 一种制备项1所述的重组III型胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：利用项5
‑
7中任一项所述的宿主细胞表达所述重组III型胶原蛋白，然后进行分离纯化得到。
[0015]9. 根据项1所述的重组III型胶原蛋白，或根据项2或3所述的核酸分子编码的重组III型胶原蛋白，或由根据项5
‑
7中任一项所述的宿主细胞产生的重组III型胶原蛋白在制备食品、化妆品、保健品或药械产品中的应用。
[0016]10. 一种组合物，其特征在于，所述组合物包括根据项1所述的重组III型胶原蛋白，或根据项2或3所述的核酸分子编码的重组III型胶原蛋白，或由根据项5
‑
7中任一项所述的宿主细胞产生的重组胶原蛋白。
[0017]11. 根据项10的组合物，其用作食品、化妆品、保健品或药械产品。
[0018]本申请为尽可能提高巴氏毕赤酵母的表达水平，采用以下策略：1)将编码重组III型胶原蛋白的各种氨基酸的密码子完全优化为巴氏毕赤酵母的偏好密码子以利于重组III型胶原蛋白的表达；2）对高密度发酵条件及工艺进行优化，发掘其高表达潜力。
[0019]有益效果本申请将重组III型胶原蛋白的活性氨基酸序列进行拼接，并根据巴氏毕赤酵母表达异源蛋白的密码子偏好性对相应的碱基序列进行密码子优化。通过菌株筛选及参数优化后，发酵液上清总蛋白浓度较优化前提高50%。
[0020]本申请采用的巴氏毕赤酵母表达系统，不含有内毒素，生产成本低，蛋白表达量较高。其生产的重组III型胶原蛋白的氨基酸组成与天然胶原蛋白α1链一致，应用于人体不会产生免疫排斥，可以广泛应用于食品、化妆品、保健品和药械产品领域，并进行工业化大规模生产。与市售的胶原蛋白产品相比，其细胞增值、迁移等功效更好。
附图说明
[0021]图1是实施例2 中重组表达载体pPIC9K
‑
COL的质粒图谱。
[0022]图2是实施例5 中重组III型胶原蛋白发酵上清液SDS
‑
PAGE电泳图。
[0023]图3是实施例6中胶原蛋白促细胞增殖的结果图。不同字母“a”、“b”、“c”、“d”代表数据间具有显著性差异，p<0.05。
[0024]图4是实施例7中胶原蛋白细胞迁移的结果图。
[0025]图5是实施例7中胶原蛋白细胞迁移率的结果图。不同字母“a”、“b”、“c”、“d”、“e”代表数据间具有显著性差异，p<0.05。
具体实施方式
[0026]下面结合附图和具体实施例来详细说明本申请。应理解，以下实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。
[0027]尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与公开本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的重组III型胶原蛋白。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示。4.一种载体，其中，所述载体包含权利要求2所述的核酸分子。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的胶原蛋白或权利要求2所述的核酸分子或权利要求4所述的载体。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为毕赤酵母。8.一种制备权利要求1所述的重组II...

【专利技术属性】
技术研发人员：周伟，陆雨婷，徐国霞，张晶，刘明明，
申请(专利权)人：华熙生物科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：