一种猪瘟病毒E2-E0融合蛋白、制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒E2

【技术实现步骤摘要】
一种猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]猪瘟(Classicalswinefever，CSF)又称猪霍乱(Hogcholera，HC)是由猪瘟病毒(HogCholeravirus，HCV或Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种急性热性致死性疾病，猪瘟具有高度接触传染性，流行广泛，发病与死亡率高，危害极大。国际兽疫局(OIE)以前将其定为A类传染病，现将期列为通报疫病，我国将其列为一类动物疫病。
[0003]CSFV为有囊膜病毒，病毒粒子大小约为40
‑
60nm。病毒基因组为单股正链RNA，长约12.3kb，含一个大的开放性阅读框(ORF)，编码一个含3898个氨基酸残基的多聚蛋白，分子量约为438kDa。多聚蛋白在翻译的同时和翻译后经病毒和宿主细胞的蛋白酶加工成12种成熟的病毒蛋白，包括结构蛋白和非结构蛋白，其多聚蛋白上从N到C端的顺序依次为：N
pro
、C、E0(E
rns
)、E1、E2、P7、NS2
‑
3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2
‑
3可被加工成NS2、NS3(P80)，除C、E0、E1和E2为结构蛋白外.其余均为非结构蛋白。结构蛋白的加工是由宿主细胞的信号肽酶介导进行的，蛋白酶首先在核衣壳蛋白C和E012前体之间剪切多聚蛋白，随后在E2的C端剪切开，最后E012被迅速剪切成E01和E2。在E2从E012前体释放以后，E01被加工成E0和E1，最后这3种囊膜糖蛋白通过分子内或分子间二硫键形成复合物，组装成病毒粒子结构。
[0004]目前采取以预防为主的综合防控策略防控猪瘟，其中灭活疫苗是猪瘟田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，但是，传统的灭活疫苗存在免疫持续期短，在生产制备过程中还存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题。基于此，研究者长期致力于CSF亚单位疫苗的研发。E0蛋白能够诱导机体产生病毒中和性抗体，是CSFV的重要保护性抗原，也是CSF亚单位疫苗研制的候选抗原。E0蛋白的氨基酸序列中存在多个糖基化位点，对于保持其抗原性具有重要作用。通过原核大肠杆菌对E0进行制备时，产物以不可溶的包涵体形式存在，且缺乏糖基化修饰，严重影响了抗原蛋白的免疫原性；通过具有完备糖基化修饰功能的真核CHO细胞对E0进行制备时，目标蛋白不表达或表达量极低，以上情况严重阻碍了CSF亚单位疫苗的研发。

技术实现思路

[0005]为了解决CSFV E0蛋白在CHO细胞中表达量低或不表达的技术问题，本专利技术经过大量研究发现，将CSFV E0蛋白进行截短并将其与CSFV E2蛋白融合后能够在CHO细胞中促进CSFV E0的表达，既不影响E2蛋白的表达，且不影响E0蛋白和E2蛋白的免疫原性，可用于CSF亚单位疫苗的制备，具体包括以下内容：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白，所述融合蛋白包括猪瘟病毒E0截短蛋白和猪瘟病毒E2蛋白；所述猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0007]优选地，编码所述猪瘟病毒E0截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]优选地，所述猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0009]优选地，编码所述猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]优选地，所述猪瘟病毒E0蛋白片段的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G；所述突变后的猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0011]优选地，编码所述突变后的猪瘟病毒E0截短蛋白突变的基因序列如SEQ ID NO.8所示。
[0012]优选地，所述猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0013]优选地，编码所述猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.10所示。
[0014]第二方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白在制备猪瘟病毒疫苗中的应用。
[0015]优选地，所述疫苗为亚单位疫苗。
[0016]第三方面，本专利技术提供了上述第一方面所述的猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的制备方法，所述方法包括：将编码猪瘟病毒E0截短蛋白和猪瘟病毒E2蛋白的基因串联后，克隆到真核表达载体中得到表达猪瘟病毒E0截短蛋白和猪瘟病毒E2蛋白的重组质粒；再将所述的重组质粒转染至CHO细胞中，培养、筛选、纯化得到猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白。
[0017]优选地，所述真核表达载体为pcDNA3.1载体。
[0018]优选地，所述CHO细胞为CHO悬浮细胞。
[0019]优选地，所述方法为：
[0020](1)PCR扩增编码猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的基因片段，所述基因片段如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；
[0021](2)用限制性内切酶Xho I、Hind III分别对载体pcDNA3.1和猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的基因片段进行双酶切，并将酶切片段用DNA连接酶连接，获得表达猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的重组质粒pcDNA3.1
‑
CSFV
‑
E2
‑
E0；
[0022](3)将重组质粒pcDNA3.1
‑
CSFV
‑
E2
‑
E0转染CHO悬浮细胞，悬浮培养，收集细胞培养上清，纯化即得猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白。
[0023]本专利技术的有益效果是：
①
通过原核大肠杆菌对E0进行制备时，产物以不可溶的包涵体形式存在，且缺乏糖基化修饰，严重影响了抗原蛋白的免疫原性；通过具有完备糖基化修饰功能的真核CHO细胞对E0进行制备时，目标蛋白不表达或表达量极低，以上情况严重阻碍了CSF亚单位疫苗的研发；而本专利技术意外发现，将猪瘟病毒E0蛋白截短获得E0蛋白，将其与猪瘟病毒E2蛋白融合，不仅能够促进E0蛋白的表达，而且不影响原有E0蛋白和E2蛋白的免疫原性，可用于CSF亚单位疫苗的制备；
②
在上述猪瘟病毒E0截短蛋白的基础上，本专利技术发现，将猪瘟病毒E0蛋白的第160本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白，其特征在于，所述E2
‑
E0融合蛋白包括猪瘟病毒E0截短蛋白和猪瘟病毒E2蛋白；所述猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白，其特征在于，所述猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。3.一种编码权利要求2所述猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.6所示。4.如权利要求1所述的猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白，其特征在于，所述猪瘟病毒E0截短蛋白的第160位、162位、165位和166位氨基酸均突变为甘氨酸G；所述突变后的猪瘟病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。5.如权利要求4所述的猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白，其特征在于，所述猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。6.一种编码权利要求5所述的猪瘟病毒E2
‑
E0融合蛋白的基因序列，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.10所示。7.如权利要求1
‑
2或权利要求4
‑
5任一所述的猪瘟病毒E2<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，茹毅，李亚军，郝荣增，杨洋，刘华南，李丹，卢炳州，张贵财，秦晓东，张越，陈娇，吴秀萍，赵东梅，任蕊芳，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：