一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用，属于核酸检测技术领域。本发明专利技术应用核酸适配体进行酶联核酸适配体乳铁蛋白的检测试剂盒。采用间接竞争的方法，将辣根过氧化物酶标记的核酸适配体顺序性地与待测样品、及固定于微孔板上的互补核酸分子反应，再加入酶催化底物进行催化反应，读取检测信号，根据信号变化检测乳铁蛋白含量。本发明专利技术采用96孔板作为固相基底，利用酶标仪进行信号检测，便于快速检测多个样品，具有高通量，同时本发明专利技术提供的酶联核酸适配体检测乳铁蛋白的方法具有较高的灵敏度和稳定性，适用于市场上配方奶粉、液体奶、乳铁蛋白营养滴剂等乳制品的快速检测。快速检测。快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]乳铁蛋白(Lf)是一种分子量约为80kDa的铁结合糖蛋白，存在于大多数哺乳动物的乳汁和哺乳动物外分泌物中，在先天免疫系统中起重要作用，能够增强机体对疾病的抵抗力，以及抗菌、抗癌和抗氧化的能力。乳铁蛋白在哺乳动物乳汁中含量丰富，如牛奶中的含量为0.02～0.35mg/mL，其蛋白质结构和氨基酸序列与人乳铁蛋白高度相似，易于被婴儿和儿童吸收。因此，乳铁蛋白已被广泛用作婴幼儿食品(尤其是奶粉)的营养强化剂，可改善婴幼儿肠道菌群，促进铁吸收，增强婴幼儿免疫力，减少脂类氧化反应。对婴幼儿尤其是非母乳喂养的婴幼儿来说，奶粉的意义重大。2012年我国食品安全国家标准GB14880
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2012将乳铁蛋白列为营养强化剂，规定乳制品和婴幼儿配方奶粉中添加的乳铁蛋白允许量不得超过≤1g/kg。由于乳铁蛋白天然存在于哺乳动物的乳汁中，因此，对乳制品中外来与内在的乳铁蛋白含量的检测非常必要。
[0003]核酸适配体(Aptamer)是从寡聚核苷酸文库中筛选得到的能够与靶分子高亲和力和高特异性结合的单链DNA或RNA。与传统的抗原抗体识别相似，核酸适配体能够与靶标分子特异性识别结合。在检测应用方面，核酸适配体相比抗体具有以下优势：分子量小、易于化学合成、成本低、容易修饰、稳定性好。在对靶分子的分析检测中，核酸适配体传感器已经成为一种有力的工具。核酸适配体作为识别分子主要应用于医学、生命科学和生物分析科学等领域，检测方法主要有可见光检测、荧光检测、电化学等。然而，市场上的核酸适配体产品很少，基本没有实现真正的规模化生产。在众多的核酸适配体应用中，基于核酸适配体识别的HRP酶催化显色方法，媲美成熟的抗体ELISA产品，操作简单，具有较大规模化生产的空间及广阔应用的市场。
[0004]目前，乳铁蛋白通过色谱法、酶联免疫吸附测定法和毛细管电泳法检测。其中色谱法与毛细管电泳法操作复杂、耗时。酶联免疫法虽然操作简单，但价格昂贵，不同产品间存在稳定性差，灵敏度低的缺陷。因此，寻找快速、灵敏、可靠的检测方法，对市场上丰富的乳制品中的乳铁蛋白的快速检测至关重要。目前，未有基于酶联核酸适配体试剂盒检测乳制品中乳铁蛋白的报道。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒及其应用，具有检测特异性强、更加快速、准确的特点。
[0006]本专利技术提供了一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，包括以下组成：
[0007]酶标记的乳铁蛋白核酸适配体和互补核酸分子包被的微孔板；所述乳铁蛋白核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0008]所述互补核酸分子的序列与所述乳铁蛋白核酸适配体互补。
[0009]优选的，在所述酶标记的所述乳铁蛋白核酸适配体中，所述酶和乳铁蛋白核酸适配体通过生物素
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链霉亲和素系统连接；
[0010]在所述互补核酸分子包被的微孔板中，所述互补核酸分子和微孔板通过生物素
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链霉亲和素系统连接。
[0011]优选的，在互补核酸分子包被的微孔板中，所述互补核酸分子的包被浓度为100～600nM。
[0012]优选的，所述互补核酸分子的长度为乳铁蛋白核酸适配体总长度的40％～100％。
[0013]优选的，所述酶标记的所述乳铁蛋白核酸适配体中酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和核酸内切Cas酶。
[0014]优选的，还包括以下一种或几种：酶催化底物显色液、洗涤液、终止液、样品稀释液和样品提取液。
[0015]本专利技术提供了所述乳铁蛋白核酸适配体所述试剂盒在检测乳制品中乳铁蛋白含量中的应用。
[0016]优选的，所述乳制品包括奶粉、液体奶和滴剂。
[0017]优选的，待检测乳制品中乳铁蛋白的浓度为1.2nM～25n M。
[0018]优选的，所述检测乳制品中乳铁蛋白含量的方法，包括以下步骤：
[0019]1)取待测样品溶于样品提取液中，离心过膜，稀释得到前处理样品；
[0020]2)将酶标记的核酸适配体加入前处理样品中，孵育，得到反应液A；
[0021]3)向互补核酸分子包被的微孔板中加入所述反应液A，孵育，洗涤，拍干；
[0022]4)向步骤3)中拍干后的微孔板中加入显色液进行显色反应，加终止液终止，使用酶标检测仪读取吸光度值，根据标准方程计算待测样品中乳铁蛋白的含量。
[0023]本专利技术提供的乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，包括以下组成：酶标记的所述乳铁蛋白核酸适配体和互补核酸分子包被的微孔板。本专利技术利用间接竞争法原理设计试剂的组成，其中待测样品与固定于微孔板上互补核酸分子竞争性地与酶标记的核酸适配体结合，再加入所述酶催化底物进行催化反应，产生检测信号，根据信号变化实现对乳铁蛋白的检测。本专利技术以乳制品中常见的蛋白为对象，评估所述核酸适配体的识别特异性，结果表明：所述核酸适配体对乳铁蛋白结合的响应值与人乳铁蛋白(H
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Lf)无显著性差异；所述核酸适配体对乳铁蛋白结合的响应值与酪蛋白(Casein)、牛血清白蛋白(BSA)、α
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乳白蛋白(α
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la)、β
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乳球蛋白(β
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lg)、转铁蛋白(Tf)的响应值相比，具有显著性差异，说明所述核酸适配体对乳铁蛋白有较强特异性，可用于乳铁蛋白的准确检测。本专利技术采用96微孔板作为固相基底，利用酶标仪进行信号检测，便于快速检测多个样品，具有高通量，本专利技术提供的试剂盒具有较高的灵敏度和稳定性以及准确性，适用于市场上大量乳制品的快速检测。本专利技术可定量检测乳制品中乳铁蛋白的含量，为准确定量检测乳铁蛋白提供了可靠的检测工具。
附图说明
[0024]图1为本专利技术提供的检测试剂盒检测乳铁蛋白示意图；
[0025]图2为本专利技术提供的检测试剂盒检测乳铁蛋白线性范围与标准曲线；
[0026]图3为本专利技术提供的检测试剂盒的检测稳定性结果；
[0027]图4为本专利技术提供的检测试剂盒中核酸适配体的检测特异性结果；其中，**p<0.05表示与空白对照组相比，所在组呈极显著差异；
[0028]图5为ELISA试剂盒与ELAA试剂盒线性范围对比结果；
[0029]图6为乳铁蛋白滴剂产品线性范围结果；
[0030]图7为链霉亲和素修饰优化实验结果，其中左图为链霉亲和素修饰浓度优化实验结果，右图为链霉亲和素修饰时间优化实验结果；
[0031]图8为牛血清蛋白封闭优化实验结果；
[0032]图9为互补核酸分子包被优化实验结果；
[0033]图10为酶联适配体浓度优化实验结果；
[0034]图11为HRP酶的缓冲液优化实验结果；
[0035]图12为TMB体积与终止时间优化实验本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括以下组成：酶标记的乳铁蛋白核酸适配体、互补核酸分子包被的微孔板；所述乳铁蛋白核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述互补核酸分子的序列与所述乳铁蛋白核酸适配体互补。2.根据权利要求1所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，在所述酶标记的所述乳铁蛋白核酸适配体中，所述酶和乳铁蛋白核酸适配体通过生物素
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链霉亲和素系统连接；在所述互补核酸分子包被的微孔板中，所述互补核酸分子和微孔板通过生物素
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链霉亲和素系统连接。3.根据权利要求2所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，在互补核酸分子包被的微孔板中，所述互补核酸分子的包被浓度为100～600nM。4.根据权利要求3所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述互补核酸分子的长度为乳铁蛋白核酸适配体总长度的40％～100％。5.根据权利要求2所述乳制品中乳铁蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记的所述乳铁蛋白核酸适配体中酶包括以下一...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱超，颜朦朦，张帆，李慧冬，陈子雷，秦宏伟，
申请(专利权)人：山东省农业科学院，
类型：发明
国别省市：