基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法，包括如下步骤：S1、使用消化酶对目标蛋白进行酶切反应，得到蛋白的酶切片段；S2、以步骤S1中得到的蛋白的酶切片段作为检测样本，候选抗体作为一抗，进行Western Blot检测，获得蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹；S3、找出步骤S2中得到的蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹图谱中具有差异的泳道，所述泳道对应的候选抗体即为可能存在两两配对的配对抗体。本发明专利技术所述的抗体配对筛选方法能快速进行初步筛选出识别不同表位的抗体，可有效缩小候选抗体数量，进而减少ELISA配对工作量，具有操作简单、成本低廉等优点，因此，在配对抗体筛选领域具有良好的应用情景。在配对抗体筛选领域具有良好的应用情景。在配对抗体筛选领域具有良好的应用情景。

【技术实现步骤摘要】
基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法。

技术介绍

[0002]配对抗体是指能同时结合在一个抗原分子上的两个抗体。通常情况下，一个抗原分子拥有多个抗原决定簇，将抗原注射入动物体内进行免疫，针对不同的抗原决定簇会产生不同的抗体。产生的抗体具有特异性与专一性，即一个抗体分子只会特异性地结合一个抗原决定簇。两个针对不同抗原决定簇的抗体，有可能同时结合到抗原分子上。如果两个抗体同时结合到同一个抗原分子上，那么这两个抗体就是配对抗体。
[0003]配对抗体目前主要运用于ELISA试剂盒的制作，配对抗体筛选的方法有双抗体夹心ELISA法、双抗体夹心胶体金免疫层析法等等。目前，最常用的配对抗体筛选的方法为双抗夹心ELISA法，其具体操作步骤是将两种可能配对的抗体，一种作为捕获抗体，另一种作为检测抗体；首先将捕获抗体包被在酶标板上，后加入抗原，再加入检测抗体，若能得到阳性信号并且与抗原含量正相关，说明捕获抗体和检测抗体能同时与抗原特异性结合，该捕获抗体与检测抗体为一对配对抗体。该方法能准确筛选用于双抗体夹心ELISA法的配对抗体，但其具有复杂的酶标、包被和加样过程，操作步骤繁琐，反应时间长，通常只能用穷举法测试任意两个候选抗体的组合，当候选抗体数量较多时工作量极大。
[0004]有鉴于此，有必要开发一种基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法，减少工作量，节省成本。

技术实现思路
/>[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法。解决现有的基于ELISA法进行配对抗体筛选时，具有复杂的酶标、包被和加样过程，操作步骤繁琐，反应时间长，通常只能用穷举法测试任意两个候选抗体的组合，当候选抗体数量较多时工作量极大等问题。
[0006]为解决现有技术中的上述问题，本专利技术是通过如下技术方案来实现的：一种基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法，包括如下步骤：S1、使用消化酶对目标蛋白进行酶切反应，得到蛋白的酶切片段；S2、以步骤S1中得到的蛋白的酶切片段作为检测样本，候选抗体作为一抗，进行Western Blot检测，获得蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹；S3、找出步骤S2中得到的蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹图谱中具有差异的泳道，所述泳道对应的候选抗体即为可能存在两两配对的配对抗体。
[0007]进一步地，所述基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法还包括采用双抗体夹心ELISA法对步骤S3中得到的可能存在两两配对的配对抗体进行确认复核的步骤。
[0008]进一步地，步骤S1中，所述消化酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶中的一种。
[0009]进一步地，步骤S1中，所述消化酶的浓度为0.2～0.5%，所述酶切反应的温度为25～40℃，酶切反应的时间为0.5～8h。
[0010]进一步地，步骤S1中，所述酶切反应体系中的缓冲液为Tris
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HCl缓冲液，pH为8.0。
[0011]进一步地，步骤S2中，所述Western Blot检测的具体方法为：将所述蛋白酶切片段和蛋白上样缓冲液混匀后，煮沸5～10min，经SDS
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PAGE分离；之后置于转移槽中进行转膜，将蛋白酶切片段转移至PVDF膜上；室温5％脱脂奶粉封闭2～4h，用封闭液稀释一抗，在温度为4℃的条件下，一抗封闭过夜；用TBST溶液洗涤3次，每次8mim，室温孵育二抗2h；用TBST溶液洗涤3次，每次9min，ECL试剂显影，获得蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹。
[0012]本专利技术还提供了上述任一项所述的基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法在大样本配对抗体筛选领域中的应用。
[0013]本专利技术的技术原理如下：若两个抗体所对应的蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹图谱存在差异，即代表这两个抗体识别不同的表位，故可通过特征指纹的差异度对配对抗体进行初步筛选。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术所述的基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法能快速进行初步筛选出识别不同表位的抗体，尤其是候选抗体数量较多时，可有效缩小候选抗体数量，进而减少ELISA配对工作量，具有操作简单、成本低廉等优点，因此，在配对抗体筛选领域具有良好的应用情景。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1为本专利技术基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法流程图，其中附图标记为：1：抗原；2：酶切后的抗原片段；3：Western Blot；4：已筛选的配对抗体；a：胰蛋白酶酶解；b：待筛选的目标抗体；c：根据特征指纹的差异度进行抗体配对筛选；图2为蛋白酶切的人血清白蛋白肽谱被待筛选抗体识别的特征指纹结果，其中附图标记为：1：T5D2 (0.1 μg/mL)；2：T4H9 (0.1 μg/mL)；3：T5E6(0.002 μg/mL)；4：T4A1 (0.002 μg/mL)；5：T4A6 (0.01 μg/mL)；6：T2C9(0.1 μg/mL)；图3为蛋白酶切的白介素
‑
6肽谱被待筛选抗体识别的特征指纹结果，其中左图为曝光30秒的图片，右边为曝光10秒的图片；附图标记为：1：K1E9B8B4；2：K4G3E6E2；3：K6E3E2G10；4：K6D1E5C12；5：K6C4B7G8；6：K6C12C4A2；7：K6B1A5G6；8：K5G2A6A5；9：K4D8E7G3；10：K4D12G2A6；11：K4C7G2A2；12：K3E12E5E7；13：K3B4A1E9；14：K2G11C7B2；15：K2F12E7A5；16：K2B9B12C9；17：K1A5G5C5；18：K1A4E9A1，其浓度均为0.1 μg/mL；图4为蛋白酶切的FLT3 Ligand蛋白肽谱被待筛选抗体识别的特征指纹结果，其中左图为曝光0.5秒的图片，右边为曝光0.1秒的图片；附图标记为：1：V4E5A6E1；2：
V4E10E9A8；3：V4D3A5H5；4：V4C7C6B1；5：V4C4G8E7；6：V3E1A3E2；7：V3C9C7H8；8：V3C3G4C3；9：V3A7C7D7；10：V3A5A8A1；11：V2E12E6G1；12：V2D9E1A8；13：V2D4D1G3；14：V2C5C4H2；15：V2B10G5C6；16：V1G12C4G11；17：V1D8E8D11；18：V1C1H5E3，其浓度均为0.1 μg/mL。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例中的附图对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、使用消化酶对目标蛋白进行酶切反应，得到蛋白的酶切片段；S2、以步骤S1中得到的蛋白的酶切片段作为检测样本，候选抗体作为一抗，进行Western Blot检测，获得蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹；S3、找出步骤S2中得到的蛋白酶切片段的肽谱识别特征指纹图谱中具有差异的泳道，所述泳道对应的候选抗体即为可能存在两两配对的配对抗体。2.如权利要求1所述的基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法，其特征在于，还包括采用双抗体夹心ELISA法对步骤S3中得到的可能存在两两配对的配对抗体进行确认复核的步骤。3.如权利要求1所述的基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法，其特征在于，步骤S1中，所述消化酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶中的一种。4.如权利要求1所述的基于对蛋白酶切的肽谱识别特征指纹的抗体配对筛选方法，其特征在于，步骤S1中，所述消化酶的浓度为0.2～0.5%，所述酶切反应的温度为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蜜，尚真真，高丽，尹丽萍，罗长义，
申请(专利权)人：武汉三鹰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：