一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。东莨菪碱人工半抗原的分子结构如式（Ⅰ），东莨菪碱人工抗原的分子结构如式（Ⅱ）。本发明专利技术的东莨菪碱人工半抗原最大程度的保留了东莨菪碱的特征结构，且在远离这些主要特征结构的端位上引入了能与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的东莨菪碱人工抗原可进行小鼠免疫获得高亲和力、高灵敏度、强特异性的抗东莨菪碱单克隆抗体，可用于对东莨菪碱进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。准确的免疫检测和免疫分析。准确的免疫检测和免疫分析。

【技术实现步骤摘要】
一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]东莨菪碱（Scopolamine）是一种莨菪烷型生物碱，主要存在于茄科植物颠茄类和曼陀罗类中，是洋金花、赛莨菪和天仙子中主要的生物碱。临床上，东莨菪碱主要用于镇痛、麻醉、抗晕动症、帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、农药中毒等，市场需求巨大。
[0003]自上世纪50年代末被用于治疗某些危重症获得成功后，该药被广泛的关注，尤其是近年来在临床医疗上应用范围日趋广泛，取得了令人注目的疗效。比如在治疗呼吸系统疾病、感染性休克、心血管疾病、消化系统疾病、神经系统疾病等疾病中都有重要用途。它的不良反应一般有口干、分泌物变稠、面色潮红、躁动不安、激动、幻觉、谵妄、尿潴留、视物模 糊、腹胀、体温升高等；偶见有心律失常及惊厥、昏迷等情况。本药小剂量表现为镇静作用，大剂量产生催眠作用。因此很有必要建立一种快速、灵敏、准确的检测东莨菪碱的方法，这有助于确定东莨菪碱的滥用。
[0004]目前，对东莨菪碱的检测主要依靠气相色谱
‑
质谱联用法（GC
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MS)、液相色谱四级杆飞行时间质谱仪（Q
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TOF LC/MS）、核磁共振氢谱（H NMR）、核磁共振碳谱（13C NMR）、核磁共振氟谱（19F NMR）、红外光谱（IR）等方法，但都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员操作等缺点，因此不能达到现代检测对简便、快速、准确的要求。
[0005]而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合的原理检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法，该方法的关键就是要制备出该小分子化合物对应的完全抗原和对该抗原具有高特异性、高亲和力的抗体。由于大多数小分子化合物（分子量小于1000），缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此不具有免疫原性，故小分子物质属于半抗原。而小分子物质通过适当的化学修饰，在半抗原分子结构的某个位点上连接上端部为活性基团的连接臂，再与大分子载体结合，就可制成半抗原
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载体偶联物即完全抗原或人工抗原，人工抗原则可以借助T细胞表位来间接诱导B细胞的增殖和分化，继而产生特异性抗体从而制备出该特异性抗体。
[0006]因此有必要提供一种有效的东莨菪碱人工抗原的制备方法，制备的东莨菪碱人工抗原可用于动物免疫制备具有特异性的抗东莨菪碱抗体，进一步用于检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术是为了克服现有技术中对东莨菪碱的检测方法都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员操作等缺点，提供了一种东莨菪碱人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用以克服上述缺陷。
[0008]为实现上述专利技术目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种东莨菪碱人工半抗原，其特征在于，
其分子结构如（Ⅰ）所示：（Ⅰ）；其中，n的范围为1~3。
[0009]本专利技术中的东莨菪碱人工半抗原，其通过对东莨菪碱进行修饰，在远离其主要活性基团的端位上引入了新的活性基团，这样既可以最大限度的保留其特征结构，又提供了可以与载体蛋白偶联的活性位点。
[0010]与采用环状的连接臂相比，本专利技术所采用的连接臂为链状，可以尽可能的降低免疫时T细胞对连接臂的识别度，这样免疫得到的抗体对东莨菪碱的特异性和亲合力更强。
[0011]作为优选，所述东莨菪碱人工半抗原，其分子结构如（
Ⅰ‑Ⅰ
）所示：（
Ⅰ‑Ⅰ
）。
[0012]本专利技术中的优选的东莨菪碱人工半抗原中采用具有丁二酸结构的连接臂，经过筛选之后发现，这种丁二酸结构的连接臂其具有更好的反应活性，同时在与蛋白载体偶联制备成人工抗原后，其效价更强，对于东莨菪碱的检测更为灵敏。
[0013]如上所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：以氢溴酸三水东莨菪碱以及二酸酐为原料，进行反应，得到东莨菪碱人工半抗原。
[0014]本专利技术中的所涉及到的东莨菪碱人工半抗原的制备方法的关键因素在于在东莨菪碱分子结构的羟基基团上引入具有羧基的活性手臂。本专利技术在经过多种合成方案筛选后，选择采用二酸酐作为原料，通过酸酐基团与羟基之间的缩合反应制备得到，本专利技术中的这种制备方法具有工艺简单有效，无需高温高压的制备条件。
[0015]作为优选，具体包括以下步骤：（1）将氢溴酸三水东莨菪碱溶于纯化水中，用氨水调节溶液的pH，经过萃取、干燥、过滤、减压蒸干得微白色油状物A；（2）将微白色油状物A溶于吡啶中，再加入二酸酐和4
‑
二甲氨基吡啶，回流搅拌反应，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂，经萃取、纯化水洗涤、干燥、过滤、减压蒸干得东莨菪碱人工半抗原。
[0016]作为优选，所述步骤（1）中用氨水调节溶液的pH为8~10；所述步骤（2）中回流搅拌反应温度为90~110℃，反应时间15~24h。
[0017]作为优选，所述二酸酐为丁二酸酐。
[0018]一种东莨菪碱人工抗原，其分子结构如（Ⅱ）所示：
（Ⅱ）；其中，n的范围为1~3。
[0019]进一步优选，东莨菪碱人工抗原，其分子结构如（
Ⅱ‑Ⅰ
）所示：（Ⅱ）。
[0020]如权利要求1所述的东莨菪碱人工抗原的制备方法，其特征在于，所述东莨菪碱人工抗原通过活泼酯法使东莨菪碱人工半抗原与牛血清蛋白结合获得。
[0021]本专利技术选用的牛血清蛋白（BSA）作为大分子载体，与其他载体蛋白相比，具有以下优点：
①
BSA具有583个氨基酸残基，较容易与东莨菪碱半抗原发生偶联，可制得不同偶联比的东莨菪碱人工抗原，且具有较高的免疫原性；
②
BSA经济实惠，成本低；
③
BSA的化学性质比较稳定，在酸性和弱碱性的环境下也有很好的溶解度和稳定性，适合长期储存。
[0022]作为优选，具体包括以下步骤：（a）将东莨菪碱人工半抗原（Ⅰ）、N
‑
羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺溶于有机溶剂中，发生反应，取上清液得到含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液；（b）将含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液滴加到牛血清蛋白溶液中，发生偶联反应，得到东莨菪碱人工抗原。
[0023]作为优选，所述步骤（a）中：东莨菪碱人工半抗原（Ⅰ）、N
‑
羟基琥珀酰亚胺以及二环己基碳二亚胺三者的摩尔比为1∶(1.2~1.5)∶(1.2~1.5)，室温搅拌反应12~24h；所述步骤（b）中：反应温度为3~6℃，反应时间10~18h。
[0024]作为优选，所述步骤（b）中：牛血清蛋白溶液的浓度为2~8 mg/ml；含有活化的东莨菪碱人工半抗原的反应液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：（8~15）。
[0025]本专利技术还提供了所述东莨菪碱人工半抗原或者东莨菪碱人工抗原在制备抗东莨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种东莨菪碱人工半抗原，其特征在于，其分子结构如（Ⅰ）所示：（Ⅰ）；其中，n的范围为1~3。2.如权利要求1所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以氢溴酸三水东莨菪碱以及丁二酸酐为原料，进行反应，得到东莨菪碱人工半抗原。3.根据权利要求2所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）将氢溴酸三水东莨菪碱溶于纯化水中，用氨水调节溶液的pH，经过萃取、干燥、过滤、减压蒸干得微白色油状物A；（2）将微白色油状物A溶于吡啶中，再加入二酸酐和4
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二甲氨基吡啶，回流搅拌反应，自然冷却至室温，减压蒸干溶剂，经萃取、纯化水洗涤、干燥、过滤、减压蒸干得东莨菪碱人工半抗原。4.根据权利要求3所述的东莨菪碱人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中回流搅拌反应温度为90~110℃，反应时间15~24h。5.一种东莨菪碱人工抗原，其特征在于，其分子结构如（Ⅱ）所示：（Ⅱ）；其中，n的范围为1~3。6.如权利要求5所述的东莨菪碱人工抗原的制备方法，其特征在于，所述东莨菪碱人工抗原通过活泼酯法使权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：王镇，邵越水，丁枭科，
申请(专利权)人：杭州同舟生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：