【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工，具体涉及一种他喷他多人工半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。
技术介绍
1、他喷他多(tapentadol)是一种新颖的作用于中枢神经系统的口服止痛药，它具有两种作用机制：一种是通过改善疼痛感觉和情感因素，抑制疼痛在脊髓中的传递，从而影响和控制感知疼痛的大脑皮层部位活动；一种是去甲肾上腺激素重吸收抑制作用的方法，临床上一般用于糖尿病周围神经病变疼痛治疗以及解除成年人中枢神经系统的中重度急性疼痛的治疗。
2、
3、目前大多采用高效液相色谱、气相色谱、质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、红外光谱等进行分析测定，由于使用以及维护成本较高，不适用于大批量采样分析，而利用其人工合成抗原进行免疫分析具有操作便捷、特异性强、测定速度快等优点，所以很有必要合成一种他喷他多人工半抗原、人工抗原来满足免疫分析的需求。
4、因此很有必要开发一种经济、简单、快速的检测方法以便检测人体内他喷他多的水平，而他喷他多人工抗原的制备则是该方法得以实现的基础。
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种他喷他多人工半抗原。
2、一种他喷他多人工半抗原，其分子结构式如式(ⅰ)所示：
3、
4、本专利技术的第二个目的是提供上述他喷他多人工半抗原的制备方法。本专利技术以(2r,3r)-3-(3-甲氧基苯基)-n,n,2-三甲基戊胺作为合成人工半抗原的起始原料，不仅最大程度地保留了他喷他多的特征结构，而
5、一种他喷他多人工半抗原的制备方法，包括以下步骤：
6、步骤(1)、将(2r,3r)-3-(3-甲氧基苯基)-n,n,2-三甲基戊胺与质量分数为48％的氢溴酸按照(100～110)mg：5ml混合，100～110℃下搅拌回流反应20～21h。结束反应后冷却至室温，转干，加入15ml去离子水，调ph至溶液呈碱性，再用乙酸乙酯萃取多次，收集乙酸乙酯相，干燥，过滤，转干，得到黄色油状物a。
7、作为优选，步骤(1)中调ph具体是：加入1n的naoh水溶液，调ph＝9；
8、作为优选，步骤(1)中乙酸乙酯萃取的次数为三次，在该反应条件下，黄色油状产物a的得率较高，后处理程序较为简单，较易提纯。
9、步骤(2)、将步骤(1)所得黄色油状物a与溴乙酸乙酯按摩尔比1：(2.5～3.5)混合于溶剂中，加入质量分数为60％的氢化钠作为催化剂，于65～70℃下搅拌回流反应18～20h，经薄层色谱分析，反应完全，直接转干，用20ml乙酸乙酯提取，过滤，转干得到黄色油状物b。
10、作为优选，步骤(2)中所述溶剂为吡啶或乙腈或n,n-二甲基甲酰胺中的一种。
11、作为优选，步骤(2)中黄色油状物a与溴乙酸乙酯摩尔比为1：3。
12、作为优选，步骤(2)中所述薄层色谱采用的展开剂为乙酸乙酯与浓氨水的混合溶剂。
13、步骤(3)、向步骤(2)所得黄色油状物b中加入四氢呋喃、甲醇和naoh水溶液，25～30℃下搅拌反应18～20h。结束反应，转干，用适量无水乙醇提取，转干，经薄层色谱分离得到他喷他多人工半抗原。
14、作为优选，步骤(3)中所述黄色油状物b、四氢呋喃、甲醇、naoh水溶液比例为(100～110)mg：2ml：1.5ml：5ml，更优选为100mg：2ml：1.5ml：5ml。
15、作为优选，步骤(3)中所述naoh水溶液的当量浓度为1n。
16、通过上述方法，在他喷他多的甲氧基位上引入连接臂，在该修饰位点上引入连接臂能最大程度地保留他喷他多特征结构。
17、与采用环状连接臂相比，本专利技术所采用的是直链作为连接臂，可减少免疫分析时的非特异性结合，还可减少免疫时产生的针对连接臂的免疫反应，从中提高产生特异性抗体的概率。
18、本专利技术的第三个目的是提供一种他喷他多人工抗原，其分子结构式如式(ⅱ)所示：
19、
20、其中，bsa为牛血清蛋白。
21、本专利技术的第四个目的是提供上述他喷他多人工抗原的制备方法，包括：通过活泼酯法使所述他喷他多人工半抗原与牛血清蛋白结合，获得所述他喷他多人工抗原。
22、具体地，采用活泼酯法制备他喷他多人工抗原，包括以下步骤：
23、步骤(1)将他喷他多人工半抗原、n,n-二环己基碳二亚胺、n-羟基丁二酰亚胺按摩尔比1：(1.35～1.5)：(1.35～1.5)混合于n,n-二甲基甲酰胺中，于20～30℃下搅拌反应18～20h，结束反应后离心，取上清液；
24、步骤(2)将所述上清液加入牛血清蛋白溶液中，所得混合液置于3～5℃，静置过夜，经透析、离心取上清液，获得所述他喷他多人工抗原。
25、如未作特殊说明，本专利技术中所述牛血清蛋白溶液是将牛血清蛋白溶于0.01m的pbs缓冲液(ph 7.2～7.4)中制成的。
26、作为优选，步骤(2)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/ml，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：5。
27、本专利技术选用牛血清蛋白(bsa)作为大分子载体，与牛丙种球蛋白(bgg)相比具有以下优点：①牛血清蛋白能够更好更多地结合他喷他多人工半抗原，从而制备不同偶联比率的人工抗原；②从实验看，牛丙种球蛋白与他喷他多人工半抗原结合后，他喷他多人工抗原受外界环境影响程度较大且自身容易在后续处理中出现蛋白脱离现象，稳定性差。而牛血清蛋白与他喷他多人工半抗原的结合在不同的ph和温度下都能长时间保存并且自身蛋白不易脱离更具稳定性；③采用牛血清蛋白与他喷他多人工半抗原结合后，相较于牛丙种蛋白，特异性识别更强；④本实验采用牛血清蛋白相较于采用牛丙种蛋白而言，价格便宜，易得，可在一定程度上降低成本。
28、本专利技术的第五个目的是提供所述他喷他多人工抗原在制备抗他喷他多抗体中的应用。
29、本专利技术的第六个目的是提供一种抗他喷他多人工抗体，由所述他喷他多人工抗原经动物免疫得到，可与他喷他多发生特异性免疫反应。
30、试验发现，将所述他喷他多人工抗原免疫新西兰白兔，获得的免疫血清的效价为1：80000。表明本专利技术的他喷他多人工抗原可免疫获得亲和力高、灵敏度高、特异性强的抗他喷他多抗体，该抗他喷他多抗体可用于他喷他多的免疫检测和分析。
31、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
32、本专利技术的他喷他多人工半抗原最大程度地保留了他喷他多的特征结构，且具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团，可作为抗原决定簇；进一步制备获得的他喷他多人工抗原可免疫获得价效高、灵敏度高、特异性强的抗他喷他多抗体，经免疫新西兰白兔获得的多克隆抗体，可用于对他喷他多进行快速、准确的免疫检测和分析。
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1.一种他喷他多人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如式(Ⅰ)所示：
2.一种权利要求1所述他喷他多人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中油状物A与溴乙酸乙酯的摩尔比为1：(2.5～3.5)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述溶剂为吡啶或乙腈或N,N-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中油状物B与四氢呋喃、甲醇、NaOH溶液比例为(100～110)mg：2ml：1.5ml：5ml。
6.一种他喷他多人工抗原，其特征在于，由权利要求1所述他喷他多半抗原偶联牛血清蛋白后纯化得到，其分子结构式如式(Ⅱ)所示：
7.一种权利要求6所述他喷他多人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述牛血清蛋白溶液的浓度为5mg/mL，上清液与牛血清蛋白溶液的体积比为1：5。
9.权利要求6所述
10.一种抗他喷他多人工抗体，其特征在于，由权利要求6所述他喷他多人工抗原经动物免疫得到，可与他喷他多发生特异性免疫反应。
...【技术特征摘要】
1.一种他喷他多人工半抗原，其特征在于，其分子结构式如式(ⅰ)所示：
2.一种权利要求1所述他喷他多人工半抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中油状物a与溴乙酸乙酯的摩尔比为1：(2.5～3.5)。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述溶剂为吡啶或乙腈或n,n-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中油状物b与四氢呋喃、甲醇、naoh溶液比例为(100～110)mg：2ml：1.5ml：5ml。
【专利技术属性】
技术研发人员：卢瑾，徐建，王镇，邵越水，丁枭科，陈亚妮，
申请(专利权)人：杭州同舟生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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