合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株及其构建方法与应用。本发明专利技术的大肠埃希菌工程菌株不具备内源合成UDP

【技术实现步骤摘要】
合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株及其构建方法与应用，属于分子生物学


技术介绍

[0002]糖胺聚糖(Glycosaminoglycans,GAG)广泛地存在于从线虫(Caenorbabditis elegnas)到人类和各级动物组织中，发挥重要的生理功能，也与许多病理过程息息相关。该类多糖在医药领域具有广泛的应用价值。此外，随着人源糖链生物活性及成药性研究的深入，某些与人源糖链的骨架结构一致的细菌产的糖胺聚糖可以作为人工合成的前体，从而实现活性人源糖链规模化制备，其高效安全制备成为研究热点。糖胺聚糖类药物成为这一研究方向的典型代表。例如，通过大肠埃希菌来源K4和K5多糖(分别与硫酸软骨素，肝素多糖未硫酸化修饰糖链骨架结构一致)的发酵制备与体外糖链硫酸化修饰技术的偶联，高效制备非动物来源的糖胺聚糖药物原料。所以，建立一种利用重组菌株发酵，较大规模制备可被荧光探针等信号分子标记的糖胺聚糖骨架糖链的方法，为开展此类多糖及衍生物的化学生物学提供了重要的手段。
[0003]细菌多糖是菌体在代谢过程中合成的对细胞有保护作用的大分子聚合物，其由各类单糖按照特定的糖苷键连接形式聚合而成，而细菌荚膜多糖是细菌多糖重要的一类。表面覆盖荚膜多糖的细菌具有侵袭性强的特点，荚膜多糖和脂多糖是主要的致病因子，会导致严重的疾病。大肠埃希菌K5菌株表面的K5荚膜多糖常引起肠外感染，引发败血病和尿路感染。大肠埃希菌K5荚膜多糖Heparosan具有与脱硫肝素类似的结构，不仅可以抑制非特异性免疫补体系统的调理活性以增加细菌毒性，从而减少吞噬细胞对病原体的吞噬作用，还可以模仿宿主肝素分子，导致免疫原性低，以逃避免疫反应。所以，通过对大肠杆菌荚膜多糖的可视化标记，从而实现对携带该荚膜多糖的菌株的可视化追踪，有望成为细菌侵染机制研究的有力工具。
[0004]由于荚膜多糖Heparosan是以[
→
4)GlcA
‑
β(1,4)
‑
GlcNAc
‑
α(1
→
]为重复二糖单元的线性长链，本专利技术成功将N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基葡萄糖或N
‑
乙酰
‑
D
‑
氨基半乳糖替换成叠氮基团修饰的GlcNAz或GalNAz，以其为二糖单元之一的形式组装在糖胺聚糖骨架上。而生物正交点击化学已广泛应用于生物分子的标记，叠氮化物以生物正交基团连接在靶标生物分子构建体中具有生物相容性高，可选择性地与炔烃或芳基膦反应。因此，本专利技术选择叠氮化物作为活细胞表面生物正交基团，选择能发生生物正交反应的荧光素作为进行探针标记的基团，实现细胞表面糖胺聚糖骨架的成像。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，尤其是基于产生可视化糖胺聚糖骨架生物分子的大肠杆菌构建，以及可视化糖胺聚糖骨架糖链在化学生物学方面的应用，本专利技术提供了合成可点击
反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株及其构建方法与应用，主要以大肠埃希菌K5为例，构建得到产生可视化肝素骨架生物分子的工程菌株。
[0006]术语说明：
[0007]UDP
‑
GlcA：中文全称为UDP
‑
葡萄糖醛酸，其作用是为糖胺聚糖骨架的合成提供活化的葡萄糖醛酸供体。
[0008]UDP
‑
GlcNAc：中文全称为UDP
‑
N
‑
乙酰葡萄糖胺，其作用是为糖胺聚糖骨架的合成提供活化的乙酰葡萄糖胺供体。
[0009]KfiA：N
‑
乙酰葡萄糖胺转移酶，其作用是与KfiC一起合成荚膜多糖Heparosan。
[0010]glmS：中文全称为谷氨酰胺
‑‑6‑
磷酸果糖氨基转移酶，其作用是催化Fru
‑
6P到GlcN
‑
6P，是UDP
‑
GlcNAc内源合成途径的关键酶分子。
[0011]NahK：中文全称为N
‑
乙酰己糖胺1
‑
激酶，来源于长双歧杆菌，其作用是催化GlcNAc(GlcNAz)到GlcNAc
‑
1P(GlcNAz
‑
1P)。
[0012]AGX1：人源UDP
‑
N
‑
乙酰基己糖胺焦磷酸化酶，其作用是催化GlcNAc
‑
1P(GlcNAz
‑
1P)到UDP
‑
GlcNAc(UDP
‑
GlcNAz)。
[0013]pmHS2：巴氏杆菌属Heparosan合酶2，其作用催化UDP
‑
GlcA和UDP
‑
GlcNAc(UDP
‑
GlcNAz)合成Heparosan(叠氮修饰Heparosan)。
[0014]GlcNAz：中文全称为N
‑
叠氮乙酰葡萄糖胺，其作用是添加在培养基中为UDP
‑
GlcNAz合成的起始底物。
[0015]UDP
‑
GlcNAz：中文全称为UDP
‑
N
‑
叠氮乙酰葡萄糖胺，其作用是为叠氮化糖胺聚糖骨架的合成提供活化的叠氮乙酰葡萄糖胺供体。
[0016]UDP
‑
GalNAz：中文全称为UDP
‑
N
‑
叠氮乙酰半乳糖胺，其作用是为叠氮化糖胺聚糖骨架的合成提供活化的叠氮乙酰半乳糖胺供体。
[0017]本专利技术技术方案如下：
[0018]合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株，其特征在于，所述大肠埃希菌工程菌株不具备内源合成UDP
‑
单糖和肝素骨架的能力，引入异源组成型UDP
‑
叠氮单糖合成途径及诱导型叠氮修饰肝素骨架合成途径，在培养基中添加叠氮单糖和诱导剂时，合成可点击反应的叠氮修饰的肝素骨架。
[0019]根据本专利技术优选的，所述大肠埃希菌工程菌株敲除了glmS基因，不具备UDP
‑
单糖内源合成能力。
[0020]根据本专利技术优选的，所述大肠埃希菌工程菌株引入了NahK、AGX1基因，具备UDP
‑
叠氮单糖合成能力。
[0021]根据本专利技术优选的，所述大肠埃希菌工程菌株引入了pmHS2基因，具备叠氮修饰肝素骨架合成能力。
[0022]上述合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0023](1)以大肠埃希菌为出发菌株，利用λRed重组酶系统无痕敲除glmS基因，阻断大肠埃希菌中的UDP
‑
单糖内源合成途径；
[0024](2)在经步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株，其特征在于，所述大肠埃希菌工程菌株不具备内源合成UDP
‑
单糖和肝素骨架的能力，引入异源组成型UDP
‑
叠氮单糖合成途径及诱导型叠氮修饰肝素骨架合成途径，在培养基中添加叠氮单糖和诱导剂时，合成可点击反应的叠氮修饰的肝素骨架。2.如权利要求1所述的大肠埃希菌工程菌株，其特征在于，所述大肠埃希菌工程菌株敲除了glmS基因，不具备UDP
‑
单糖内源合成能力。3.如权利要求1所述的大肠埃希菌工程菌株，其特征在于，所述大肠埃希菌工程菌株引入了NahK、AGX1基因，具备UDP
‑
叠氮单糖合成能力。4.如权利要求1所述的大肠埃希菌工程菌株，其特征在于，所述大肠埃希菌工程菌株引入了pmHS2基因，具备叠氮修饰肝素骨架合成能力。5.权利要求1所述的合成可点击反应肝素骨架的大肠埃希菌工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以大肠埃希菌为出发菌株，利用λRed重组酶系统无痕敲除glmS基因，阻断大肠埃希菌中的UDP
‑
单糖内源合成途径；(2)在经步骤(1)改造的大肠埃希菌中插入NahK、AGX1基因，引入异源组成型UDP
‑
叠氮单糖合成途径，并插入pmHS2基因，引入诱导型叠氮修饰肝素骨架合成途径...

【专利技术属性】
技术研发人员：生举正，王钰佳，侯进，于婕，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：