一种生产乳清酸的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了生产乳清酸的基因工程菌及其构建方法与应用，所述基因工程菌为不含质粒、从头合成高产乳清酸的基因工程菌E.coli Ora，与现有的乳清酸生产菌相比，该基因工程菌具有遗传稳定性好、发酵产率高、糖酸转化率高等优势，所述基因工程菌以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成乳清酸，乳清酸产量可高达135.6g/L，具有很好的工业应用前景；该基因工程菌对大肠杆菌中嘧啶类核苷酸代谢网络中与乳清酸相关代谢流进行分析重构，加强了乳清酸合成和积累；之后引入野生型枯草芽孢杆菌嘧啶核苷操纵子中的二氢乳酸脱氢酶，进一步加强乳清酸合成，适合规模化工业生产的需要。适合规模化工业生产的需要。适合规模化工业生产的需要。

A genetically engineered bacterium for producing whey acid and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
23857)二氢乳酸脱氢酶B基因pyrK(NCBI
‑
Gene ID:936854经密码子优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和pyrD(NCBI
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Gene ID:938008经密码子优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.7)，并由同一个P
trc
启动子启动。
[0010]优选的，上述生产乳清酸的基因工程菌，所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌E.coli W3110(ATCC 27325)。
[0011]优选的，上述生产乳清酸的基因工程菌，所述鸟氨酸氨甲酰转移酶基因为基因argF(NCBI
‑
Gene ID:944844)。
[0012]优选的，上述生产乳清酸的基因工程菌，所述乳清酸磷酸核糖转移酶基因为基因pyrE(NCBI
‑
Gene ID:948157)。
[0013]上述生产乳清酸的基因工程菌的构建方法，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110染色体基因组进行定向改造，具体步骤如下：
[0014](1)为了进一步增加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产乳清酸的基因工程菌，其特征在于：命名为E.coli Ora，所述基因工程菌E.coli Ora是在野生型大肠杆菌的染色体基因组上敲除鸟氨酸氨甲酰转移酶基因；染色体基因组上敲除乳清酸磷酸核糖转移酶基因，并在基因组ycgH位点上整合乳清酸磷酸核糖转移酶基因，并由P
lac
启动子启动；在基因组yciQ位点上串联整合氨基甲酰磷酸合成酶基因carA、carB，并由同一个P
trc
启动子启动；在基因组ygaY位点上串联整合天冬氨酸氨基甲酰转移酶基因pyrB、二氢乳清酸酶基因pyrC和二氢乳清酸还原酶基因pyrD，并由同一个P
trc
启动子启动；在基因组yghX位点上串联整合经密码子优化后的野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168二氢乳酸脱氢酶B基因pyrK和pyrD，并由同一个P
trc
启动子启动。2.根据权利要求1所述的生产乳清酸的基因工程菌，其特征在于：所述野生型大肠杆菌为大肠杆菌E.coliW3110。3.根据权利要求1所述的生产乳清酸的基因工程菌，其特征在于：所述鸟氨酸氨甲酰转移酶基因为基因argF。4.根据权利要求1所述的生产乳清酸的基因工程菌，其特征在于：所述乳清酸磷酸核糖转移酶基因为基因pyrE。5.权利要求1所述生产乳清酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110染色体基因组进行定向改造，具体步骤如下：(1)对鸟氨酸氨甲酰转移酶编码基因argF进行敲除；(2)将编码乳清酸磷酸核糖转移酶的pyrE基因敲除，并重新整合pyrE基因至基因组ycgH位点上，并由P
lac
弱启动子控制；(3)将氨基甲酰磷酸合成酶基因carA和carB基因串联整合至大肠杆菌基因组的yciQ位点，用同一个P
trc
启动子控制转录；(4)将pyrB基因、pyrC基因和pyrD基因串联整合至大肠杆菌基因组的ygaY位点，用同一个P
trc
启动子控制转录；(5)引入野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis 168嘧啶核苷pyr操纵子中的二氢乳酸脱氢酶B基因pyrK和pyrD，经密码子优化后串联整合至大肠杆菌基因组yghX位点，用同一个P
trc
启动子控制转录。6.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产乳清酸中的应用。7.根据权利要求6所述的基因工程菌的应用，其特征在于：利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵的调控方案为：按10％
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15％接种量接种菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，36℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0
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7.2；添加60％葡萄糖溶液维持发酵进行，发酵周期30
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32h。8.根据权利要求7所述的基因工程菌的应用，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐庆阳，李长庚，孙鹏杰，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：