一种生产2制造技术

本发明专利技术公开了一种生产2

One production 2

【技术实现步骤摘要】
一种生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用


[0001]本专利技术涉及一种生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用，属于合成生物学、微生物代谢工程技术和发酵工程技术等领域。

技术介绍

[0002]人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是母乳中含量仅次于乳糖和脂类的第三大成分，是200多种不易消化和非营养性碳水化合物的复杂混合物。其可作为益生元刺激双歧杆菌和乳杆菌等有益菌群的生长，作为受体类似物抑制致病微生物对结肠黏膜的黏附，也可作为免疫调节因子，降低免疫相关的非传染性疾病的发生，利于婴儿肠道正常的消化、吸收、分泌及免疫功能的建立，同时HMOs还可以提供大脑发育和认知所需的潜在必需营养素，有助于刺激婴幼儿大脑发育以及改善认知学习能力。2'
‑
岩藻糖基乳糖(2'
‑
fucosyllactose，2'
‑
FL)作为母乳中分泌最丰富的人乳寡糖，约占总HMOs的30％，有研究表明其在预防疟疾的发生有重要作用，由于其具有的营养和医药价值，受到更加广泛的关注。
[0003]一般2
′‑
岩藻糖基乳糖可通过分离纯化或者体外合成法生产。但因其含量低、原料来源不足以及步骤繁琐等问题，无法实现其从母乳中直接分离纯化制备。体外合成人乳寡糖主要包括化学合成法、酶法合成(包括化学
‑
酶法)以及生物法等。其中，化学法需要精确地选择性保护不同羟基以及去保护等反应，过程复杂，副反应和副产物比例高，无法实现高效率合成。目前国内外研究较多的是采用酶法合成(化学
‑
酶法)2
′‑
岩藻糖基乳糖。作为化学合成法的有效替代途径，可根据糖基供体与受体的构型筛选合适的酶类，可以减少化学法中存在的严谨的设计保护基团及立体异构性等要求。然而，供体核糖苷价格昂贵，酶催化活性低，每批次合成量仅为毫克级，无法实现规模化和工业化生产的迫切需要。近年来，利用系统生物学、代谢工程和途径工程等技术手段构建微生物基因工程菌生产2
′‑
岩藻糖基乳糖的研究持续受到关注。微生物发酵具有条件温和、成本低、环境友好等特点，已成为当今研究热点。随着代谢工程和合成生物学的发展，多种微生物合成途径中酶的克隆表达变得越来越广泛。目前研究较多的是以大肠杆菌Escherichia coli作为底盘细胞，其具有代谢产出鸟嘌呤5'
‑
二磷酸
‑
β
‑
L
‑
岩藻糖(5'
‑
diphospho
‑
β
‑
Lfucose，GDP
‑
L
‑
fucose)的2条完整通路(从头合成途径和补救途径)，通过构建代谢合成途径中的关键酶基因，以重组质粒方式进行过量表达，表达外源α
‑
1，2
‑
岩藻糖基转移酶，发酵生产2'
‑
FL。
[0004]融合蛋白标签是指在蛋白质的N端或C端融合一段蛋白序列，其目的在于增强重组蛋白质的可溶性表达，以提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量。研究表明某些高度可溶的蛋白质，如谷胱甘肽S
‑
转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白A(TrxA)、转录终止抗终止因子(NusA)、蛋白二硫键折叠异构酶(DsbA)等，在与其它易形成包涵体的蛋白质融合后会促进融合蛋白质的可溶性表达。此外，近年来发现的泛素相关小修饰蛋白(SUMO)融合标签也被证明具有促进蛋白正确折叠的作用，可以调节融合蛋白与外源蛋白之间的作用，从而提高外源蛋白的溶解性。融合蛋白标签提供了一种外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的有效策略，但由于外源蛋白在大肠杆菌中不表达或表达量很低的因素很多，例如翻
译过程中因不正确折叠而形成无活性的包涵体，或是形成了非正确配对的二硫键造成蛋白质的不稳定表达，不同蛋白标签促进外源蛋白在大肠杆菌中表达的效果不同。
[0005]利用微生物代谢途径合成2
′‑
岩藻糖基乳糖的研究集中于合成途径的构建、代谢竞争途径的基因敲除、辅因子的强化等方面，而关于α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的高效表达方面鲜有报道。在2'
‑
FL合成途径中，α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶催化供体GDP
‑
L
‑
Fuc转移至底物乳糖的半乳糖基上合成2
′‑
岩藻糖基乳糖，其稳定性和催化活性是高效合成2
′‑
岩藻糖基乳糖的关键限速步骤。现有技术受限于GDP
‑
L
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岩藻糖的胞内合成路径产量过低，导致岩藻糖基化人乳寡糖的产量过低，达不到工业化生产的需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种生产2
′‑
岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株，对2
’‑
岩藻糖基乳糖从头合成途径关键酶进行不同表达水平的调控，以提高途径效率，提高2
’‑
岩藻糖基乳糖生产水平。
[0007]本专利技术提供了一种生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组菌株，以大肠杆菌为宿主，进行了如下至少一种改进：
[0008](1)过表达甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，磷酸甘露糖变位酶ManB，GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶Gmd，GDP
‑
岩藻糖合成酶WcaG，DNA结合转录激活因子RcsA和RcsB，带有N端融合蛋白标签2
’‑
岩藻糖基乳糖合成酶FutC，β
‑
半乳糖苷透性酶LacY，糖外排转运蛋白SetA，鸟苷激酶Gsk和NADP(+)
‑
依赖性葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶zwf；
[0009](2)敲除GDP
‑
甘露糖甘露糖水解酶NudD，β
‑
半乳糖苷酶LacZ，GDP
‑
甘露糖水解酶NudK，十一磷酸葡萄糖
‑1‑
磷酸转移酶WcaJ，L
‑
岩藻糖异构酶FucI，L
‑
岩藻糖激酶FucK，HslVU蛋白酶的ATPase成分ClpY，HslVU蛋白酶的肽酶成分ClpQ，Lon蛋白酶Lon，L
‑
鼠李糖异构酶RhaA，L
‑
阿拉伯糖异构酶AraA。
[0010]在一种实施方式中，所述过表达是将基因在质粒上多拷贝表达。
[0011]在一种实施方式中，所述宿主可以是大肠杆菌BL21 star(DE3)、大肠杆菌K12 MG1655或大肠杆菌JM109；
[0012]在一种实施方式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组菌株，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，进行了如下至少一种改进：(1)过表达甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，磷酸甘露糖变位酶ManB，GDP
‑
甘露糖
‑
4,6
‑
脱水酶Gmd，GDP
‑
岩藻糖合成酶WcaG，DNA结合转录激活因子RcsA和RcsB，2
’‑
岩藻糖基乳糖合成酶FutC，β
‑
半乳糖苷透性酶LacY，糖外排转运蛋白SetA，鸟苷激酶Gsk和NADP(+)
‑
依赖性葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶zwf；(2)敲除GDP
‑
甘露糖甘露糖水解酶NudD，β
‑
半乳糖苷酶LacZ，GDP
‑
甘露糖水解酶NudK，十一磷酸葡萄糖
‑1‑
磷酸转移酶WcaJ，L
‑
岩藻糖异构酶FucI，L
‑
岩藻糖激酶FucK，HslVU蛋白酶的ATPase成分ClpY，HslVU蛋白酶的肽酶成分ClpQ，Lon蛋白酶Lon，L
‑
鼠李糖异构酶RhaA，L
‑
阿拉伯糖异构酶AraA。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌BL21 star(DE3)、大肠杆菌K12 MG1655或大肠杆菌JM109。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述过表达是将基因在质粒上多拷贝表达。4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述质粒是pRSF
‑
Duet
‑
1、pET
‑
Duet
‑
1或pCDF
‑
Duet
‑
1。5.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述基因工程菌利用pRSF
‑
Duet
‑
1质粒表达基因ManC、ManB、Gmd和WcaG；和/或利用pET
‑
Duet
‑
1质粒表达基因RcsA、RcsB和FutC；和/或利用pCDF
‑
Duet

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，张康，宿玲恰，王蕾，王璐瑶，张梦薇，蔡博涵，刘同乐，王胜，高圣琦，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：