用于检测核酸修饰的方法和系统技术方案

本公开的方面涉及用于修饰和检测甲基化核苷酸的方法。实施方案涉及RNA甲基化的检测。公开用于全转录组检测mRNA中的N6‑

Methods and systems for detecting nucleic acid modifications

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测核酸修饰的方法和系统
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年10月10日提交的美国临时专利申请第62/913475号的优先权权益，将其全部内容通过引用并入本文。
[0003]政府权利声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的HG008935政府支持下完成的。美国政府对本专利技术享有一定的权利。

技术介绍

[0005]I.专利

[0006]本专利技术一般地涉及分子生物学领域。某些方面涉及用于检测甲基化核酸分子的方法和组合物。
[0007]II.背景
[0008]核酸具有广泛的化学修饰。许多这些修饰用于对各种细胞和生物过程施加重要影响。RNA修饰最近已成为基因表达程序的关键转录后调节因子。它们影响多种真核生物过程，并且许多这些修饰的正确沉积是正常发育所必需的1。RNA修饰是调节RNA代谢的组成部分。最丰富的内部mRNA修饰是N6‑
甲基腺苷(m6A)，它几乎影响RNA代谢的所有方面，包括剪接、翻译和降解2。然而，m6A在不同发育过程和生物学背景中的机制作用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于检测核酸分子的甲基化核苷酸的方法，包括：(a)在足以将官能团连接至甲基化核苷酸的条件下，将核酸分子与甲基转移酶和包含官能团的S
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腺苷
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甲硫氨酸(SAM)类似物一起孵育；(b)使核酸分子经受足以产生互补核酸分子的条件，所述互补核酸分子包含在对应于甲基化核苷酸的残基处的突变；和(c)对互补核酸分子进行测序。2.根据权利要求1所述的方法，其中甲基化核苷酸是甲基化腺苷。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述甲基化核苷酸是N6‑
甲基腺苷。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中官能团与SAM类似物的硫原子连接。5.根据权利要求4所述的方法，其中SAM类似物具有式：其中R包含官能团。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中官能团不是甲基。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中官能团具有至少两个碳原子。8.根据权利要求7所述的方法，其中官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。9.根据权利要求8所述的方法，其中官能团是烯丙基基团。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述SAM类似物具有式：11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中甲基转移酶是RNA甲基转移酶。13.根据权利要求12所述的方法，其中RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。14.根据权利要求13所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1或KsgA。16.根据权利要求15所述的方法，其中二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。17.根据权利要求16所述的方法，其中二甲基转移酶是MjDim1。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，还包括将核酸分子与双原子卤素分子一起孵育。19.根据权利要求18所述的方法，其中将核酸分子与双原子卤素分子一起孵育是将来自双原子卤素分子的卤素原子连接至核苷酸。20.根据权利要求19所述的方法，其中双原子卤素分子是碘(I2)。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的方法，其中(b)包括使核酸分子与逆转录酶(RT)进行逆转录反应以产生互补核酸分子。22.根据权利要求21所述的方法，其中互补核酸分子是cDNA分子。23.根据权利要求21或22所述的方法，其中RT是HIV RT或其变体、M
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MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Klentaq聚合酶或其变体或Bst聚合酶或其变体。24.根据权利要求23所述的方法，其中RT是Bst聚合酶或其变体。25.根据权利要求24所述的方法，其中RT是Bst 2.0DNA聚合酶。26.根据权利要求23所述的方法，其中RT是Klentaq聚合酶或其变体。27.根据权利要求1
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26中任一项所述的方法，其中测序包括下一代测序。28.根据权利要求1
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26中任一项所述的方法，其中测序包括单分子测序。29.根据权利要求1
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26中任一项所述的方法，其中测序包括纳米孔测序。30.根据权利要求1
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29中任一项所述的方法，其中甲基化核苷酸是甲基化腺苷，并且其中残基不包括腺嘌呤。31.根据权利要求1
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30中任一项所述的方法，其中甲基化核苷酸是甲基化腺苷，并且其中残基包括鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶。32.根据权利要求1
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31中任一项所述的方法，还包括将另外的核酸分子中的突变鉴定为对应于甲基化核苷酸。33.根据权利要求1
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32中任一项所述的方法，其中核酸分子是核糖核酸分子。34.根据权利要求33所述的方法，其中核糖核酸分子是信使RNA(mRNA)分子。35.根据权利要求34所述的方法，还包括在(a)之前，向mRNA分子提供寡聚脱氧胸苷引物以产生双链区。36.根据权利要求35所述的方法，还包括提供核酸酶并且使mRNA经受足以用核酸酶消化双链区的条件。37.根据权利要求36所述的方法，其中核酸酶是RNA酶H。38.根据权利要求1
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37中任一项所述的方法，其中核酸分子是较长核酸的片段。39.根据权利要求38所述的方法，其中片段的长度为100个至200个核苷酸。40.根据权利要求1
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39中任一项所述的方法，其中核酸分子是从对象样品中分离出来的。41.根据权利要求40所述的方法，其中核酸分子是从活检样品中分离出来的。42.根据权利要求40或41所述的方法，其中样品是液体样品。43.根据权利要求1
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42中任一项所述的方法，其中核酸分子是从囊泡中分离出来的。
44.根据权利要求43所述的方法，其中囊泡是外泌体。45.根据权利要求1
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42中任一项所述的方法，其中核酸分子是无细胞核酸分子。46.根据权利要求45所述的方法，其中无细胞核酸分子是无细胞RNA(cfRNA)分子。47.一种试剂盒，其包含：(a)包含官能团的S
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腺苷
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l
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甲硫氨酸(SAM)类似物；和(b)二甲基转移酶。48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中在适当条件下，相对于未甲基化核苷酸，二甲基转移酶能够优先将官能团连接至甲基化核苷酸。49.根据权利要求47或48所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是RNA甲基转移酶。50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是Dim1或KsgA。52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是HsDim1、ScDim1或MjDim1。53.根据权利要求52所述的试剂盒，其中二甲基转移酶是MjDim1。54.根据权利要求47
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53中任一项所述的试剂盒，其中官能团与SAM类似物的硫原子连接。55.根据权利要求54所述的试剂盒，其中SAM类似物具有式：其中R包含官能团。56.根据权利要求47
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55中任一项所述的试剂盒，其中官能团不是甲基基团。57.根据权利要求47
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56中任一项所述的试剂盒，其中官能团具有至少两个碳原子。58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中官能团是具有至少两个碳的烷基或具有至少两个碳的烯基。59.根据权利要求58所述的试剂盒，其中官能团是烯丙基基团。60.根据权利要求59所述的试剂盒，其中SAM类似物具有式：
61.根据权利要求47
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60中任一项所述的试剂盒，还包含寡聚脱氧胸苷引物。62.根据权利要求47
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61中任一项所述的试剂盒，还包含核酸酶。63.根据权利要求62所述的试剂盒，其中核酸酶是RNA酶H。64.根据权利要求47
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63中任一项所述的试剂盒，还包含逆转录酶(RT)。65.根据权利要求64所述的试剂盒，其中RT是HIV RT或其变体、M
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MuLV RT或其变体、AMV RT或其变体、Bst聚合酶或其变体或Klentaq聚合酶或其变体。66.根据权利要求65所述的试剂盒，其中RT是Bst聚合酶或其变体。67.根据权利要求66所述的试剂盒，其中RT是Bst 2.0DNA聚合酶。68.根据权利要求65所述的试剂盒，其中RT是Klentaq聚合酶或其变体。69.根据权利要求47
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68中任一项所述的试剂盒，还包含RNA去甲基化酶。70.根据权利要求69所述的试剂盒，其中RNA去甲基化酶是脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)。71.根据权利要求47
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70中任一项所述的试剂盒，还包含锰盐。72.根据权利要求47
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71中任一项所述的试剂盒，还包含dNTP。73.根据权利要求47
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72中任一项所述的试剂盒，还包含无核酸酶水。74.一种用于分析包含N6‑
甲基腺苷的甲基化信使核糖核酸(mRNA)分子的方法，所述方法包括：(a)将mRNA分子片段化以产生包含N6‑
甲基腺苷的片段；(b)在足以将烯丙基基团连接至片段中的N6‑
甲基腺苷的条件下，提供甲基转移酶和包含烯丙基基团的S
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腺苷
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甲硫氨酸(SAM)类似物；(c)在足以产生包含对应于N6‑
甲基腺苷的残基的cDNA分子的条件下将片段与逆转录酶一起孵育，其中残基包括鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；(d)对cDNA分子进行测序以产生序列；和(e)使用序列识别mRNA分子中N6‑
甲基腺苷的位置。75.根据权利要求74所述的方法，还包括在(a)之前，在足以使寡聚脱氧胸苷引物与mRNA分子区域杂交的条件下，将mRNA分子与寡聚脱氧胸苷引物一起孵育，从而产生双链区。76.根据权利要求75所述的方法，还包括在足以消化双链区的条件下提供核酸酶。77.根据权利要求76所述的方法，其中核酸酶是RNA酶H。78.根据权利要求74
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77中任一项所述的方法，其中SAM类似物具有式：
79.根据权利要求74
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78中任一项所述的方法，其中甲基转移酶是RNA甲基转移酶。80.根据权利要求79所述的方法，其中RNA甲基转移酶是二甲基转移酶。81.根据权利要求80所述的方法，其中二甲基转移酶是Dim1/KsgA二甲基转移酶。82.根据权利要求81所述的方法，其中二甲基转...

【专利技术属性】
技术研发人员：何川，胡璐璐，
申请(专利权)人：芝加哥大学，
类型：发明
国别省市：