诱导多能干细胞来源间充质干细胞前体细胞及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞及其制备方法。本发明专利技术的诱导多能干细胞来源间充质干细胞的前体细胞，较比一般的间充质干细胞或诱导多能干细胞来源间充质干细胞，其功能性更为强化，且增殖能力更优异。更优异。更优异。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】(Endothelin
‑
1)、血管内皮生长因子A(VEGF
‑
A)、血小板反应蛋白
‑
2、胎盘生长因子(PlGF)、血小板衍生因子(PDGF
‑
AA)、β神经生长因子(β
‑
NGF)，及肝素结合表皮生长因子(HB
‑
EGF)等功能性蛋白。
[0033]在本说明书中，上述内皮抑素(Endostatin)是来源于天然生成的XVIII型胶原蛋白的20kDa C末端片段，其被报道是一种抗血管生成抑制剂。
[0034]在本说明书中，上述内皮素
‑
1(endothelin
‑
1)，也称为内皮素前体
‑
1(preproendothelin
‑
1，PPET1)，是一种由EDN1基因编码的蛋白，生成于血管内皮细胞。已知内皮素
‑
1(endothelin
‑
1)是一种强效血管收缩剂。
[0035]在本说明书中，上述血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF
‑
A)，作为一种由VEGFA基因编码的蛋白，已知其借助与血管内皮细胞的VEGFR1和VEGFR2的相互作用，诱导血管的生长。
[0036]在本说明书中，上述血小板反应蛋白
‑
2，作为一种由THBS2基因编码的蛋白，已知其介导细胞－细胞相互作用或细胞－基质相互作用。血小板反应蛋白
>‑
2在癌症中发挥的作用仍存在争议，但据报道称，其可调节间充质干细胞的细胞表面特性，并参与细胞粘附和细胞迁移。
[0037]在本说明书中，上述胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)是由PFG基因编码的蛋白，已知其作为血管内皮生长因子亚家族(VEGF sub
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family)的一员，是在胚胎发育期间的血管生成方面发挥主要作用的一种蛋白。
[0038]在本说明书中，上述血小板衍生因子(platelet
‑
derived growth factor，PDGF
‑
AA)作为一种调节细胞生长和分裂的生长因子，已知其在血管的生成和生长，及间充质干细胞的增殖、趋化和迁移方面发挥重要作用。
[0039]在本说明书中，神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)作为一种神经亲和性因子和神经肽，其主要参与神经的生长、维持、增殖和存活。NFG是三种蛋白的复合物，其中，α
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、β
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，和γ
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NGF的表达比例约为2:1:2。已知其中的γ
‑
NGF发挥丝氨酸蛋白酶的作用，通过切割beta
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NGF的N
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末端来激活NGF。
[0040]在本说明书中，上述肝素结合表皮生长因子(hepari
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binding EGF
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like growth factor，HB
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EGF)是一种由HBEGF基因编码的EGF家族(EGF family)蛋白的成员。已知HB
‑
EGF在心脏发育和血管分布方面发挥重要作用，其在表皮创伤愈合方面，还是上皮化过程中的必需蛋白。
[0041]依据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供一种间充质干细胞的前体细胞的制备方法，其包括以下步骤：
[0042]在包含FBS和bFGF的培养基中，培养诱导多能干细胞1～10天；及
[0043]分离SSEA
‑
4(
‑
)细胞并在包含FBS和bFGF的培养基中培养1～10天。
[0044]本专利技术的上述间充质干细胞的前体细胞，与上述间充质干细胞的前体细胞属于同种细胞，因此，省略两者的共同内容。
[0045]依据本专利技术的一个实现例，上述诱导多能干细胞，是在逆向分化用培养基中培养来源于人类的脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜、羊水或胎盘等的体细胞制备而得的。
[0046]具体地，上述体细胞包括：成纤维细胞(fibroblast)、干细胞(hepatocyte)、脂肪
细胞(adipose cell)、上皮细胞(epithelial cell)、表皮细胞(epidermal cell)、软骨细胞(chondrocyte)、肌细胞(muscle cell)、心肌细胞(cardiac muscle cell)、黑色素细胞(melaonocyte)、神经细胞(neural cell)、胶质细胞(glial cell)、星形胶质细胞(astroglial cell)、单核细胞(monocyte)、巨噬细胞(macrophage)，或来源于骨髓、脐带、脐带血、脂肪组织、羊水、臼齿牙蕾(tooth bud)的间充质干细胞等，但不限于此。
[0047]在本说明书中，阶段特异性胚胎抗原
‑
4(stage
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specific embryonic antigen
‑
4，SSEA
‑
4)是人类的诱导多能干细胞和胚胎干细胞的特征性细胞表面标记之一。在本专利技术的一个实现例中，在分化成本专利技术的间充质干细胞前体细胞(BxC)的过程中，上述SSEA
‑
4可被用作筛选因子，用以区分保留诱导多能干细胞特性的细胞和丧失诱导多能干细胞特性的细胞。
[0048]在本专利技术的一个实现例中，本专利技术人培养诱导多能干细胞，并以是否表达SSEA
‑
4为准进行筛选，分离SSEA
‑
4(
‑
)细胞后，完成进一步培养。
[0049]在本专利技术的一个实施例中，上述诱导多能干细胞，及SSEA
‑
4(
‑
)细胞，具体地，可培养1～10天、3～10天、5～10天，更具体地，可培养5～7天或7～10天。
[0050]在本专利技术的一个实现例中，上述诱导多能干细胞在培养1～10天之后，SSEA
‑
4(
‑
)细胞的分离可使用荧光激活细胞分选(fluorescence
‑
activated cell sorting，FACS)或磁性激活细胞分选(magnetic
‑
activated cell sorting，MACS)方法，优选地，可使用FACS方法，但不限于此，可不受限地使用本领域已知的细胞分离方法。
[0051]在本专利技术的另一个实现例中，上述培养细胞的培养基包含5～20％，5～15％，10～15％或10～20％的FBS，最具体地，包含10％的FBS，但不限于此。
[0052]在本专利技术的另一个实现例中，上述培养细胞的培养基包含的1～20ng/ml、2～20ng/ml、3～20ng/m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含间充质干细胞(mesenchymalstem cell，MSC)的前体细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少80％以上的细胞为CD73
+
、CD90
+
或CD105
+
。2.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述细胞群体中至多5％以下的细胞为SSEA
‑
、CD34
+
或CD45
+
。3.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述间充质干细胞的前体细胞，相较于等量的同种组织来源的间充质干细胞，其以更高的水平表达选自由ANKRD1、CPE、NKAIN4、LCP1、CCDC3、MAMDC2、CLSTN2、SFTA1P、EPB41L3、PDE1C、EMILIN2、SULT1C4、TRIM58、DENND2A、CADM4、AIF1L、NTM、SHISA2、RASSF4及ACKR3组成的组中的一个或多个基因。4.根据权利要求1所述的细胞群体，其中所述间充质干细胞的前体细胞，相较于等量的同种组织来源的间充质干...

【专利技术属性】
技术研发人员：金秀，
申请(专利权)人：布瑞克斯奥根株式会社，
类型：发明
国别省市：