一种无外源成分的间充质干细胞培养方法技术

本发明专利技术公开了一种无外源成分的间充质干细胞培养方法，采用组织块贴壁培养法进行原代培养，操作简单，缩短样本处理时间，降低了成本。原代培养基和传代培养基均采用间充质干细胞无血清培养基，避免了引入外源成分，保证了培养过程的温度性和临床安全性；传代培养时选用不含动物源成分和酚红成分的特定重组酶，提高了干细胞形态的稳定性和存活率。高了干细胞形态的稳定性和存活率。高了干细胞形态的稳定性和存活率。

【技术实现步骤摘要】
一种无外源成分的间充质干细胞培养方法


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，尤其涉及一种无外源成分的间充质干细胞培养方法。

技术介绍

[0002]大约25年前，脐带还被作为废物处理，然而随着其组织中存在这大量干细胞的发现，它的地位不断提升，可以说是“变废为宝”。人脐带间充质干细胞存在于新生儿脐带华通氏胶和血管周围的组织，是干细胞的一种。同最早发现的骨髓间充质干细胞比较，人脐带来源的间充质干细胞绝大多数生物学特征与骨髓源间充质干细胞相似，在细胞数量、细胞因子分泌能力、扩增能力方面均不弱于骨髓来源的间充质干细胞，并且比骨髓来源的间充质干细胞取材方便，容易获得，又不存在伦理道德方面的争议。
[0003]近年来，随着科研工作者对人脐带间充质干细胞研究兴趣的日益浓厚，以及应用范围的愈发广泛，人脐带间充质干细胞的培养方式也日益便利和完善。但仍然存在一定的问题：酶消化法分离脐带间充质干细胞需要消耗一定时间，使分离时间延长；细胞分离之后多选用含有一定比例胎牛血清的培养基进行培养，给脐带间充质干细胞的后期临床应用带来了一定影响；传代时选用含动物源成分或酚红成分的重组酶在培养过程中对细胞的形态和存活率存在一定的潜在影响。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种无外源成分的间充质干细胞培养方法，至少包括以下步骤：
[0005](1)原代培养：
[0006](1.1)剪取10cm左右脐带组织转入培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短转入新的装有氯化钠注射液的培养皿中，剥离脐带血管和外膜获得华通氏胶组织；
[0007](1.2)将华通氏胶组织用氯化钠注射液清洗8～10次，转入离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块，用巴氏吸管吸取华通氏胶组织糜浆于培养瓶中，用移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部；
[0008](1.3)待组织贴壁后，向培养瓶中加入原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面；将培养瓶放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养；
[0009](2)传代培养
[0010](2.1)待(1.3)中50％以上的组织块周围爬出细胞且细胞的融合度达到80％以上时，吸取培养瓶中一半以上的上清离心得到离心上清，然后吸弃多余的培养上清和组织块并用氯化钠注射液清洗；所述细胞的融合度达到80％以上，指细胞贴壁并且完全舒展以后，细胞所占的面积是培养表面面积的80％以上。
[0011](2.2)向培养瓶加入重组酶消化细胞，消化完成后加入离心上清得到细胞悬液；
[0012](2.3)将细胞悬液转移至离心管，并向培养瓶中加入氯化钠注射液清洗，收集清洗
后的细胞悬液加入离心管与原细胞悬液混合，离心弃上清，加入氯化钠注射液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，加入传代培养基重悬，混匀；
[0013](2.4)将混匀的细胞重悬液接种至培养瓶，放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养，获得传代细胞；待传代细胞的融合度达到80％以上时，按照上述方法继续传代培养；直至获得第三代细胞。
[0014]作为一种优选的技术方案，所述(1.3)中组织贴壁的标准为：将培养瓶倒扣，组织不会滑脱，且组织与瓶底接触无肉眼可见的水渍。
[0015]作为一种优选的技术方案，所述(1.3)培养瓶放入培养箱中培养3～6天时，观察细胞生长情况，组织块周围如果有梭状贴壁细胞出现，补充原代培养基。
[0016]作为一种优选的技术方案，所述(1.3)培养瓶放入培养箱中培养7～9天时，观察细胞生长情况，如果30％以上的组织块边缘有细胞爬出，更换原代培养基。
[0017]作为一种优选的技术方案，所述(2.2)中重组酶不含动物源成分和酚红。
[0018]作为一种优选的技术方案，所述重组酶为重组胰蛋白酶，购自GIBCO，货号12563
‑
029。
[0019]作为一种优选的技术方案，所述(2.2)中向培养瓶加入重组酶消化细胞时，首先晃动培养瓶，使重组酶完全覆盖瓶底后开始消化，消化时间为2～5min。
[0020]作为一种优选的技术方案，所述(2.2)中消化完成的标准为80％以上细胞收缩变圆。
[0021]作为一种优选的技术方案，所述(2.3)中传代培养基为间充质干细胞无血清培养基。
[0022]本专利技术还提供了一种传代培养的人脐带间充质干细胞，根据上述所述的一种无外源成分的间充质干细胞培养方法培养得到。
[0023]有益效果：
[0024]本专利技术提供了一种无外源成分的间充质干细胞培养方法，采用组织块贴壁培养法进行原代培养，操作简单，缩短样本处理时间，降低了成本。原代培养基和传代培养基均采用间充质干细胞无血清培养基，避免了引入外源成分，保证了培养过程的温度性和临床安全性；传代培养时选用不含动物源成分和酚红成分的特定重组酶，提高了干细胞形态的稳定性和存活率。
附图说明
[0025]图1是实施例1培养的人脐带间充质干细胞制备成的工作细胞库细胞的形态图。
具体实施方式
[0026]结合以下本专利技术的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本专利技术的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本专利技术所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本专利技术中提供的任何定义不一致，则以本专利技术中提供的术语定义为准。
[0027]在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由
…
制备”与“包含”同义，
“
包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本专利技术的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本专利技术实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本专利技术的范围之外。
[0028]为了解决上述问题，本专利技术的第一方面提供了一种无外源成分的间充质干细胞培养方法，至少包括以下步骤：
[0029](1)原代培养：
[0030](1.1)剪取10cm左右脐带组织转入培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短转入新的装有氯化钠注射液的培养皿中，剥离脐带血管和外膜获得华通氏胶组织；
[0031](1.2)将华通氏胶组织用氯化钠注射液清洗8～10次，转入离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块，用巴氏吸管吸取华通氏胶组织糜浆于培养瓶中，用移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部；
[0032](1.3)待组织贴壁后，向培养瓶中加入原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种无外源成分的间充质干细胞培养方法，其特征在于：至少包括以下步骤：(1)原代培养：(1.1)剪取10cm左右脐带组织转入培养皿中，用止血钳将脐带中残血挤出、剪短转入新的装有氯化钠注射液的培养皿中，剥离脐带血管和外膜获得华通氏胶组织；(1.2)将华通氏胶组织用氯化钠注射液清洗8～10次，转入离心管中，用眼科剪剪成体积为1～2mm3的小块，用巴氏吸管吸取华通氏胶组织糜浆于培养瓶中，用移液管将组织均匀平铺于培养瓶底部；(1.3)待组织贴壁后，向培养瓶中加入原代培养基，加入后缓慢晃动瓶身，使培养基完全覆于底面；将培养瓶放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养；(2)传代培养(2.1)待(1.3)中50％以上的组织块周围爬出细胞且细胞的融合度达到80％以上时，吸取培养瓶中一半以上的上清离心得到离心上清，然后吸弃多余的培养上清和组织块并用氯化钠注射液清洗；(2.2)向培养瓶加入重组酶消化细胞，消化完成后加入离心上清得到细胞悬液；(2.3)将细胞悬液转移至离心管，并向培养瓶中加入氯化钠注射液清洗，收集清洗后的细胞悬液加入离心管与原细胞悬液混合，离心弃上清，加入氯化钠注射液重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，加入传代培养基重悬，混匀；(2.4)将混匀的细胞重悬液接种至培养瓶，放入37.0℃，5.0％CO2培养箱中培养，获得传代细胞；待传代细胞的融合度达到80％以上时，按照上述方法继续传代培养；直至获得第三代细胞。2.根据权利要求1所述的一种无外源成分的间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述(1.3)中组织贴壁的标准为：将培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，葛晨曦，张钰，吴丹枫，
申请(专利权)人：达瑟儿上海生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：