一种孵育染色方法与应用技术

本发明专利技术涉及充质干细胞鉴定领域，尤其涉及一种孵育染色方法。所述孵育染色方法的包括以下步骤：(1)细胞样本的制备：在处理后的细胞中加入抗体工作液，得要细胞样本；(2)孵育染色：将细胞样本避光孵育染色；(3)洗涤：孵育染色结束后使用生理盐水以350

【技术实现步骤摘要】
一种孵育染色方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种孵育染色方法与应用，属于细胞鉴定
，所属IPC分类号为C07K14/47。

技术介绍

[0002]流式分析技术是一种重要的细胞分析技术，其是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术，流式分析是通过荧光染料或携带荧光染料抗体对细胞或检测单元进行荧光染色，经过流式细胞分选仪进行分离、纯化、富集特定染色体的技术。在携带荧光染料抗体在与细胞或检测单元作用之前需要先对携带荧光染料抗体在与细胞或检测单元进行孵育染色，使抗体与抗原充分结合这样才能够很好的对细胞或检测单元进行定性或定量分析。所以说孵育染色是流式分析技术关键的一个步骤，现有的孵育染色方法使得在流式分析时荧光强度太弱、并且容易出现染色不均的现象，这样导致染色时出现一些非特异性染色而影响了检测结果。
[0003]专利CN112063581A提供了一种CD29抗体在鉴定、分选人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞中的应用，该方法生物学方法筛选出对人胎盘平滑绒毛膜源间充质干细胞(PMSCs)具有良好检测稳定性的标记物CD29，可替代表达不稳定的CD90对PMSCs进行快速且准确的鉴定。但是通过单一的CD29并能够很准确的鉴别出干细胞，并且该方法可能会出现其他

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术的第一个方面提供了一种孵育染色方法，所述孵育染色方法的包括以下步骤：
[0005](1)细胞样本的制备：在处理后的细胞中加入抗体工作液，得要细胞样本；
[0006](2)孵育染色：将细胞样本避光孵育染色；
[0007](3)洗涤：孵育染色结束后使用生理盐水以350
‑
300g的离心加速度离心15
‑
20min，弃上清；
[0008](4)检测：在洗涤后的细胞样本中加入生理盐水以500
‑
550g的离心加速度离心5
‑
10min后上机检测。
[0009]在一种优选的实施方式中，所述孵育染色方法的包括以下步骤：
[0010](1)细胞样本的制备：在处理后的细胞中加入抗体工作液，得要细胞样本；
[0011](2)孵育染色：将细胞样本避光孵育染色；
[0012](3)洗涤：孵育染色结束后使用生理盐水以375g的离心加速度离心18min，弃上清；
[0013](4)检测：在洗涤后的细胞样本中加入生理盐水以525g的离心加速度离心8min后上机检测。
[0014]在一种实施方式中，所述抗体工作液由生理盐水和抗体组成。
[0015]在一种实施方式中，所述生理盐水与抗体的体积比为(97
‑
97.4)：(2.6
‑
3)；进一步优选的，所述生理盐水与抗体的体积比为97.6：2.4。
[0016]在一种实施方式中，所述生理盐水为0.9wt％生理盐水，采购于广东大冢制药。
[0017]申请人发现，在本专利技术体系中使用生理盐水，尤其是0.9wt％生理盐水，能够提高阳性CD105的检出率。可能是因为在本专利技术中PE anti
‑
CD105中的藻红蛋白(PE)提高了CD105的阳性识别率，然后其与0.9wt％生理盐水的协同相互作用下提高了其阳性检出率。
[0018]在一种实施方式中，所述细胞为P3
‑
P6代冻存的人间充质干细胞。
[0019]在一种实施方式中，所述P3
‑
P6代冻存的人间充质干细胞为P3
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P6代冻存的人脐带间充质干细胞、P3
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P6代冻存的人胎盘间充质干细胞、P3
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P6代冻存的人羊膜间充质干细胞、P3
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P6代冻存的人牙髓间充质干细胞、P3
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P6代冻存的人脂肪间充质干细胞中的一种；进一步优选的，所述P3
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P6代冻存的人间充质干细胞为P3
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P6代冻存的人脐带间充质干细胞、P3
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P6代冻存的人胎盘间充质干细胞、P3
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P6代冻存的人脂肪间充质干细胞中的一种；更进一步优选的，所述P3
‑
P6代冻存的人间充质干细胞为P3
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P6代冻存的人脂肪间充质干细胞(比如说P3代冻存的人脂肪间充质干细胞、P4代冻存的人脂肪间充质干细胞、P5代冻存的人脂肪间充质干细胞、P6代冻存的人脂肪间充质干细胞，优选用P5代冻存的人脂肪间充质干细胞)。
[0020]P3
‑
P6代冻存的人间充质干细胞指的是将经过传代培养后冻存的人间充质干细胞。
[0021]在一种实施方式中，取细胞，将其在37℃下水浴锅中，待细胞溶解后，加入生理盐水以300g的离心加速度离心10min，弃上清得到步骤(1)中处理后的细胞，其中，每1
×
105个细胞加入1ml生理盐水。
[0022]在一种实施方式中，所述抗体为PE anti
‑
human CD90、PE anti
‑
CD105、PE anti
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human CD166中的一种；进一步优选的，所述抗体为PE anti
‑
CD105。
[0023]在一种实施方式中，所述PE anti
‑
CD105采购于Biolegend。
[0024]在一种实施方式中，步骤(1)中处理后的细胞加入抗体工作液中的加入方式为滴加方式，滴加速度为15
‑
20μl/s，优选为18μl/s。
[0025]申请人意外发现，在本专利技术中使用特定速度的滴加方式加入处理后的细胞，这样使得染色的效果更好。当滴加的速度过快时，使得在后续的孵育染色过程中抗体与抗原的接触不均出现染色不均的现象，当滴加的速度过慢时，这样使得其他一些生物杂质对其对后续的孵育染色造成了影响，出现了非特异性染色。
[0026]在一种实施方式中，处理后的细胞：抗体工作液＝(5
×
103‑1×
104)个：1μl，优选为7.2
×
103个：1μl。
[0027]申请人发现，在本专利技术中需要加入特定的抗体的量进行孵育染色，当抗体的量过多过少时的孵育染色效果不好。可能是因为抗体的量过多，会造成染色不均的现象，从而影响了染色结果，而当抗体的加入量太少，没有足够的抗体与抗原结合使得荧光现象减弱。
[0028]在一种实施方式中，步骤(2)中孵育染色的温度为5～8℃；进一步优选的，步骤(2)中孵育染色的温度为7℃。
[0029]在一种实施方式中，步骤(2)中孵育染色的时间为30～40min；进一步优选的，步骤(2)中孵育染色的时间为35min。
[0030]申请人经过大量研究发现，在使用CD105作为细胞表面标志物时，使用PE anti
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CD105抗体时需要本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种孵育染色方法，其特征在于，所述孵育染色方法的包括以下步骤：(1)细胞样本的制备：在处理后的细胞中加入抗体工作液，得要细胞样本；(2)孵育染色：将细胞样本避光孵育染色；(3)洗涤：孵育染色结束后使用生理盐水以350
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300g的离心加速度离心15
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20min，弃上清；(4)检测：在洗涤后的细胞样本中加入生理盐水以500
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550g的离心加速度离心5
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10min后上机检测。2.根据权利要求1所述的一种孵育染色方法，其特征在于，所述抗体工作液由生理盐水和抗体组成。3.根据权利要求2所述的一种孵育染色方法，其特征在于，所述生理盐水与抗体的体积比为(97
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97.4)：(2.6
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3)。4.根据权利要求1所述的一种孵育染色方法，其特征在于，所述细胞为P3
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P6代冻存的人间充...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，
申请(专利权)人：达瑟儿上海生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：