一种细胞的传代培养方法与应用技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种细胞的传代培养方法。所述细胞的传代培养方法可培养P1

【技术实现步骤摘要】
一种细胞的传代培养方法与应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体来说，涉及一种细胞的传代培养方法与应用。

技术介绍

[0002]间充质干细胞来源于中胚层，是一种具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞，主要具有自我更新和分化潜能两个特征。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层非造血系的成体干细胞。MSCs最初是从骨髓中分离得到的，但是随着研究的深入，人体的其他组织中也分离出了MSCs，包括脂肪、肌肉、脐带血、外周血、肺和心脏等。其中人脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景，对人脐带间充质干细胞的原代和传代培养也越来越多。目前，在脐带间充质干细胞的传代培养过程中，对人脐带间充质干细胞使用的一些胰酶对其进行消化，但是现有的一些胰酶中使用的是酚红重组酶，其超过一定时间会导致细胞不能贴壁或者死亡，对细胞的损失过大，细胞的增殖能力下降，当细胞连续传代多次，则会出现细胞老化死亡等现象。
[0004]因此急需建立一套有效的细胞的传代培养方法，满足人脐带间充质干细胞在科学研究与应用上的需要。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术的第一个方面提供了一种细胞的传代培养方法，所述细胞的传代培养方法可培养P1
‑
P25代人脐带间充质干细胞时均保持增殖能力；步骤包括：
[0006](1)离心：取装有细胞的培养瓶，轻轻拍打瓶身，使组织块脱落，用移液管吸取培养瓶中的上清离心得到离心上清后备用，培养瓶中的为悬浮细胞；
[0007](2)清洗：使用清洗液清洗悬浮细胞，然后吸弃清洗液；
[0008](3)消化：向培养瓶中加入重组酶进行消化，至80％
‑
90％细胞收缩变圆后终止消化，得到细胞悬液；
[0009](4)洗涤：将细胞悬液转移至离心管中，向培养瓶中加入清洗液，吹打清洗，收集清洗后的细胞悬液转入装有细胞悬液的离心管中；
[0010](5)收获计数：将步骤(4)中装有细胞悬液的离心管进行第一次离心、弃上清，第一次加入培养基重悬细胞沉淀，将多个离心管重悬后的细胞沉淀合并为1管后加入清洗液进行离心、弃上清，第二次加入培养基、混匀后计细胞数及存活率；
[0011](6)细胞接种：在培养瓶中加入培养基混匀后接种步骤经过步骤(5)处理的细胞悬液，操作完成后，培养瓶上贴上标签，将培养瓶放入温度为37.0℃，CO2浓度为5.0％的培养箱中。
[0012]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述步骤(1)中细胞的局部融合度为80％
‑
90％。
[0013]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述步骤(1)中离心为450
‑
700g离心5min。
[0014]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述清洗液为0.9％氯化钠注射液。
[0015]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述重组酶为Tryple Select Enzyme(1X),no phenol red。
[0016]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述步骤(3)中终止消化的方法为：加入步骤(1)中的离心上清。
[0017]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述培养基的配方为Sf900 II无血清培养基、FreeStyle
TM
293 Expression Medium、EliteGroTM
‑
Adv、NEAA、0.4％组氨酸溶液、生长因子。
[0018]作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤(5)中的离心为300
‑
450g离心5min。
[0019]作为本专利技术一种优选的技术方案，步骤(5)中第一次加入培养基的量为20
‑
50ml/cm2；步骤(5)中第二次加入培养基的量为2
‑
4ml/cm2。
[0020]本专利技术的第二个方面提供了一种细胞的传代培养方法的应用，所述传代培养方法可用于培养间充质干细胞。
[0021]有益效果：
[0022]1.在本专利技术选择了特定的培养基和重组酶使得传代培养后的细胞具有良好的形态、较高的增殖力和存活率；
[0023]2.本专利技术使用的重组酶主要成分是重组胰蛋白酶，优点在于区别于重组胰酶具有与动物源性胰蛋白酶相同的酶学性质，但是不含任何动物源成分，提高使用安全性另外此产品未加入酚红，区别于有酚红重组酶，可以避免酚红对细胞培养过程的潜在影响；
[0024]3.在本专利技术的步骤(5)中采用了两次离心的方法，传代培养后细胞的形态更均一；
[0025]4.采用本专利技术的方法对人脐带间充质干细胞进行传代培养方法使得细胞，一直到P25代人脐带间充质干细胞还保持增殖能力。
附图说明
[0026]图1为实施例1中P23代人脐带间充质干细胞的细胞形态图。
具体实施方式
[0027]参选以下本专利技术的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本专利技术的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
[0028]如本文所用术语“由
…
制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0029]连接词“由
…
组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由
…
组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
[0030]当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0031]单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
[0032]说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本专利技术并不限定于该具体数量，还本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞的传代培养方法，其特征在于，所述细胞的传代培养方法可培养P1
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P25代细胞时均保持增殖能力；步骤包括：(1)离心：取装有细胞的培养瓶，轻轻拍打瓶身，使组织块脱落，用移液管吸取培养瓶中的上清离心得到离心上清后备用，培养瓶中的为悬浮细胞；(2)清洗：使用清洗液清洗悬浮细胞，然后吸弃清洗液；(3)消化：向培养瓶中加入重组酶进行消化，至80％
‑
90％细胞收缩变圆后终止消化，得到细胞悬液；(4)洗涤：将细胞悬液转移至离心管中，向培养瓶中加入清洗液，吹打清洗，收集清洗后的细胞悬液转入装有细胞悬液的离心管中；(5)收获计数：将步骤(4)中装有细胞悬液的离心管进行第一次离心、弃上清，第一次加入培养基重悬细胞沉淀，将多个离心管重悬后的细胞沉淀合并为1管后加入清洗液进行离心、弃上清，第二次加入培养基、混匀后计细胞数及存活率；(6)细胞接种：在培养瓶中加入培养基混匀后接种步骤经过步骤(5)处理的细胞悬液，操作完成后，培养瓶上贴上标签，将培养瓶放入温度为37.0℃，CO2浓度为5.0％的培养箱中。2.根据权利要求1所述的一种细胞的传代培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中细胞的局部融合度为80％
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90％。3.根据权利要求1所述的一种细胞的传代培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中离心为450
‑
70...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，吴丹枫，
申请(专利权)人：达瑟儿上海生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：