表征四臂NHS酯PEG的方法技术

本文提供了一种表征待检样品中四臂NHS酯PEG的方法，其包括1)让所述待检样品与1

Method for characterizing four arm NHS ester peg

【技术实现步骤摘要】
表征四臂NHS酯PEG的方法


[0001]本专利技术涉及表征四臂NHS酯PEG的方法，尤其是对四臂NHS酯PEG衍生化后通过反相色谱分析进行表征的方法。

技术介绍

[0002]聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)是一种线性的亲水性高分子化合物，无毒、生物相容性良好，抗原性低。将PEG与一些药物分子(如蛋白、多肽、小分子药物、脂质体等)共价偶联后，可将PEG的这些优良性质赋予所形成的偶联药物分子。目前，全球批准上市的聚乙二醇修饰药物已多达数十个，包括PEG修饰腺苷脱氢酶(PEG
‑
ADA)、PEG修饰天冬酰胺酶、PEG修饰干扰素等蛋白药物，以及PEG修饰喜树碱(PEG
‑
CPT)、PEG修饰阿霉素等小分子药物。
[0003]聚乙二醇修饰技术经历了几十年的发展，已经开发出了多种PEG修饰剂，其中包括多臂(分枝)PEG修饰剂，例如二臂PEG修饰剂和四臂PEG修饰剂(如四臂NHS酯PEG)等。相对于单臂PEG修饰剂，多臂PEG修饰剂的一些优势可包括，提高了对修饰位点的选择性；在修饰位点有限的情况下增加了PEG载量；可有效阻止细胞或其他大分子(如抗体)接触该被修饰分子，从而增加半衰期和减小免疫原性，等等。
[0004]在制备四臂NHS酯PEG或使用四臂NHS酯PEG过程中，经常需要对样品进行表征，即确定其纯度、杂志含量和/或杂质种类。现有技术表征四臂NHS酯PEG的方法有紫外分光光度计法，但是用该方法表征时，会受游离的NHS干扰，导致结果不准确；另一方法为高效液相色谱法，该方法所用的流动相为乙腈和水，但是用该方法表征时，具有不同数量活性NHS酯基团的四臂NHS酯PEG分子不能达到有效分离，导致检测结果不准确。

技术实现思路

[0005]在一方面，本文提供了一种表征待检样品中四臂NHS酯PEG的方法，其包括：
[0006]1)让所述待检样品与1
‑
萘甲胺在乙腈中反应，生成用于进行反相色谱分析的色谱样品；以及
[0007]2)对所述色谱样品进行反相色谱分析。
[0008]在一些实施方案中，所述待检样品与1
‑
萘甲胺在常温下反应不少于1小时。
[0009]在一些实施方案中，所述待检样品与1
‑
萘甲胺在常温下反应不少于4小时。
[0010]在一些实施方案中，所述反相色谱分析采用如下流动相：
[0011]1)流动相A，其包括以下体积百分比的成分：水：四丁基硫酸氢铵＝(90
‑
95)：(5
‑
10)；
[0012]2)流动相B，其包括以下体积百分比的成分：乙腈：甲醇：四丁基硫酸氢铵＝(80
‑
90)：(8
‑
18)：(2
‑
5)。
[0013]在一些实施方案中，所述反相色谱分析采用如下流动相：
[0014]1)流动相A，其包括以下体积百分比的成分：水：四丁基硫酸氢铵＝95：5；
[0015]2)流动相B，其包括以下体积百分比的成分：乙腈：甲醇：四丁基硫酸氢铵＝85：10：5。
[0016]在一些实施方案中，所述反相色谱分析中使用的流动相色谱梯度为：
[0017]0min：70％流动相A，30％流动相B；
[0018]15min：40％流动相A，60％流动相B；以及
[0019]21min：70％流动相A，30％流动相B。
[0020]在一些实施方案中，所述四臂NHS酯PEG具有下式(IV)的结构：
[0021][0022]其中n为80至150之间的整数。
[0023]在一些实施方案中，所述待检样品包括如下(I
‑
IV)式所示的四臂NHS酯PEG中的任一个或其任意组合：
[0024][0025][0026][0027][0028]其中n为80至150之间的整数。
[0029]在一些实施方案中，所述表征包括检测所述待检样品中的四臂NHS酯PEG的含量和种类。
[0030]本文提供的方法可有效地区分样品中含有不同NHS酯基团数量的四臂NHS酯PEG，检测目标分子和杂质分子的种类并进行定量。
附图说明
[0031]图1为采用本文提供的流动相进行反相色谱分析的代表性色谱图。峰A：1
‑
萘甲胺；峰B：一取代物生成的萘甲胺衍生物；峰C：二取代物生成的萘甲胺衍生物；峰D：三取代物生成的萘甲胺衍生物；峰E四取代物生成的萘甲胺衍生物。
[0032]图2为采用普通流动相(水和乙腈)进行反相色谱分析的代表性色谱图。
具体实施方式
[0033]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0034]“四臂PEG”在本文中指四个PEG分子直接或通过连接基团间接连接至同一碳原子或同一小分子而形成的分枝状分子。在一个实例中，四个PEG分子可直接通过醚键连接至作为核心的季戊四醇。四臂PEG也涵盖其衍生物，尤其是游离PEG末端带有活性基团的衍生物，如四臂NHS酯PEG。对于四臂PEG中的PEG部分，其长短基本上没有限制，例如平均分子量可在200至20000Da(例如200、400、600、800、1000、1500、2000、4000、5000、6000、8000、10000、20000Da等)，大概包括4
‑
500个单体分子。换言之，PEG部分中CH2CH2O重复单元的数量n可以为4
‑
500之间的任何整数，例如，5、10、20、50、100、150、200、300、400、500等。分子量或n值超过上述范围通常也是可行的。
[0035]“四臂NHS酯PEG”为四臂PEG活性酯的一种，指四臂PEG分子中的游离PEG末端与N
‑
羟基琥珀酰亚胺(NHS)形成活性酯键。在一个实例中，该游离PEG末端通过丁二酸分子形成NHS酯。在制备或购买的四臂NHS酯PEG产品中，除了四个游离PEG末端均具有NHS活性酯的目标分子外，通常会存在一些酯化不完全的杂质分子，例如仅一个PEG臂、两个PEG臂或三个PEG臂游离端形成NHS酯的杂质。为了描述方便，以下将四臂PEG分子中在四个游离PEG末端均具有NHS活性酯的四臂NHS酯PEG称为四取代物，而将四个游离PEG末端共计具有一个NHS活性酯、两个NHS活性酯和三个NHS活性酯的杂质分子分别称为一取代物、二取代物和三取代物，以反映分子中的活性酯基团数量。在一个具体实例中，这些一取代物、二取代物、三取代物和四取代物可分别具有下式(I)、(II)、(III)和(IV)的结构。
[0036][0037][0038][0039][0040]在式(I
‑
IV)中，n可为4至500的整数，例如80至150之间的整数。
[0041]应理解，在某个具体四臂PEG分子中，不同臂的CH2CH2O重本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表征待检样品中四臂NHS酯PEG的方法，包括：1)让所述待检样品与1
‑
萘甲胺在乙腈中反应，生成用于进行反相色谱分析的色谱样品；以及2)对所述色谱样品进行反相色谱分析。2.如权利要求1所述的方法，其中所述待检样品与1
‑
萘甲胺在常温下反应不少于1小时。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述待检样品与1
‑
萘甲胺在常温下反应不少于4小时。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中所述反相色谱分析采用如下流动相：1)流动相A，其包括以下体积百分比的成分：水：四丁基硫酸氢铵＝(90
‑
95)：(5
‑
10)；2)流动相B，其包括以下体积百分比的成分：乙腈：甲醇：四丁基硫酸氢铵＝(80
‑
90)：(8
‑
18)：(2
‑
5)。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中所述反相...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静，宫丽敏，刘佳，严玖凤，
申请(专利权)人：盘锦凯正医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：