一种高通量检测多肽的方法技术

本发明专利技术提供了一种高通量检测多肽的方法，主要解决批量多肽样品检测耗时长，方法需不断调整的问题。将本发明专利技术选用的多肽样本注入高效液相色谱法分析仪，以常规键合硅胶为色谱柱填料，采用紫外检测器，选用乙腈和水为流动相，三氟乙酸为离子对试剂，梯度洗脱，检测波长为210

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测多肽的方法


[0001]本专利技术涉及多肽检测，具体涉及一种高通量检测多肽的方法。

技术介绍

[0002]由于多肽药物结构复杂、稳定性差、浓度低且目标分子与杂质的结构相类似，有的只有一个氨基酸的差别，因此多肽药物的分离纯化一直是多肽药物生产过程中最具挑战性的一部分。
[0003]分离纯化技术对于生物分子的形态、收率和成本具有决定性的作用。尤其是生物表达的多肽药物，由于浓度低、杂质复杂，目标产物容易变性，使其分离成本占总成本的60％以上，而且需要多步纯化过程才能满足多肽药物的需求，因此，分离纯化技术在多肽药物产业中起着十分重要的作用。
[0004]传统重结晶、精馏等有机小分子药物纯化方法不适用于多肽的分离纯化，高效液相色谱或层析技术具有极高的分离纯化效率，且条件温和，在分离纯化过程中容易保持目标分子的生物活性，成为多肽药物分离纯化的重要工具。多肽分离纯化主要依赖于高性能的微球制备色谱填料，其具有分离效果好、分辨率高、重复性好、回收率高等优点，是目前多肽药物的主要分离纯化方法。
[0005]目前用于多肽药物分离纯化的层析或色谱技术主要是有三种：离子交换色谱、反相色谱和疏水作用色谱。其中多肽的常规高效液相色谱检测，通常使用反相色谱柱，根据多肽序列性质，选择适合的流动相组成、比例，以及检测梯度等条件，针对性的进行检测。而生物分离实际应用中经常遇见极性多肽和不同疏水性多肽的混合物，特别是全盲条件下肽序列检测，通过序列性质来进行检测及优化的时长较久，或者是待检数量很多，一对一根据序列进行仔细分析设计检测条件的效率很低。
[0006]色谱分离是一个物理过程，样品分子经过在固定相与流动相之间的多次分配、吸附解吸，由于不同分子与固定相和流动相之间的相互作用力的差异而使它们在色谱柱中的移动速度不同，以此实现分离的目的。通常带有－COOH、－NH2等极性基团的化合物(如多肽类)比较容易产生拖尾。而拖尾原因主要是，对表面上连接有硅羟基的硅原子来说，其中一个键连接了一个羟基，其它三个键都与一个氧原子相连，由于氧的电负性比硅强，三个氧原子对硅原子产生了吸电子效应，因此对于硅上的羟基而言，这个硅原子对羟基是一个吸电子基团，使得硅羟基具有一定的酸性，其pKa约为4.5～4.7。根据电离规律，流动相的pH－pKa>2即pH>6.7时，99％以上的硅羟基应该是呈离子状态的，即Si－O－，而pKa－pH>2即pH<2.5时，酸性环境抑制了硅羟基的电离，99％以上的硅羟基应该是呈分子状态的，即Si－OH，但其极性仍然存在，即Si－Oδ－Hδ+。
[0007]色谱柱固定相中的硅羟基则具有的一定的极性Si－Oδ－Hδ+，在pH一定的条件下甚至还会发生电离，形成－Si－O－形式的离子态。Si－Oδ－Hδ+和－Si－O－对于极性化合物之间的作用力则是一种极性的静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多，同时，因为硅胶表面键合了C18长链，由于空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基的机会不会
很多，只有少部分的分子才能与残余硅羟基产生作用。这样，大多数的样品分子如非极性分子一样均匀前移，而少量的样品分子由于这种静电作用力的存在而被推迟洗脱出来，导致样品分子的浓度分布发生变化，产生后拖。拖尾严重的程度与样品分子极性大小和残余硅羟基的多少有着直接的关系。也就是说残余硅羟基对样品的次级保留效应是导致峰形后拖的主要原因。
[0008]鉴于此，需要提供一种可以满足大量的多肽样本的高通量检测的方法。

技术实现思路

[0009]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高通量检测多肽的方法，主要解决批量多肽样品检测耗时长，检测条件需根据多肽性质不断调整的问题，可大幅提高检测通量，同时可用于全盲条件下的多肽检测。
[0010]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种高通量检测多肽的方法，其特征在于，采用反向高效液相色谱分析仪进行检测，检测器为紫外检测器，89.9％
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99.9％水、0.1％三氟乙酸和0％
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10％乙腈，流动相B为质量百分比的89.9％
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99.9％乙腈、0.1％三氟乙酸和0％
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10％水，梯度洗脱检测波长为210
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220nm；流速为0.3
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0.4mL/min；进样体积为1ul；柱温为35
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40℃。优选地，流动相A为质量百分比99.9％水和0.1％三氟乙酸，流动相B为质量百分比的99.9％乙腈和0.1％三氟乙酸。
[0011]在本专利技术的一些实施例中采用Agilent 1260Ⅱ反相高效液相色谱分析仪。
[0012]根据范德姆特方程，本方法下相应规格色谱柱流速应为0.35mL/min左右为最大柱效流速。结合仪器泵精密度、系统压力、保留时间等原因，最终流速定位0.3
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0.4mL/min。经实测多肽样本比较HPLC图谱分析，发现流速为0.3与0.4mL/min时，图谱峰信息基本一致。
[0013]在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，常须添加离子对试剂来达到优化峰型和保留时间的效果，往流动相中加酸将流动相的pH调至2.5以下有助于改善峰形，这种方式，主要用于改善对带羧基化合物的拖尾，加入酸的作用是，一方面抑制了硅羟基的离子化，另一方面也抑制了有机酸的离子化，因而削弱了－COO－与Si－Oδ－Hδ+的相互作用，减小了拖尾，其中多使用三氟乙酸作为离子对试剂，流动相中的三氟乙酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。
[0014]三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm，对多肽在低波长处的检测干扰很小。改变三氟乙酸的浓度，可以细微地调整多肽在反相色谱上的选择性。这一影响对于优化分离条件、增大复杂色谱分析(如多肽的指纹图谱)的信息量是非常有益的。
[0015]三氟乙酸添加在流动相中的浓度一般为0.1％，在这个浓度下，大部分的反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟乙酸浓度大大低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就变得十分明显。
[0016]优选地，色谱柱采用大小为2.1*100mm，填料粒径1.8μm，规格。根据范德姆特方程，色谱柱的柱长(L)/填料粒径(dp)值密切相关.L/dp值越大，理论塔板数越高，因此待使用的色谱柱的L/dp值应与常规色谱柱L/dp值保持一致或更高，根据目前的常规规格，色谱柱柱长通常低于250mm，为提高柱效，填料粒径应尽可能的小。经理论计算，最终选择2.1*100mm，1.8μm，规格的色谱柱。
[0017]优选地，梯度洗脱的条件为：以流动相A90
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95％，流动相B5
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10％开始进行洗脱逐渐减小流动相A的比例，增加流动相B的比例，6
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测多肽的方法，其特征在于，采用反向高效液相色谱分析仪进行检测，检测器为紫外检测器，流动相A为质量百分比89.9%
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99.9%水、0.1%三氟乙酸和0%
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10%乙腈，流动相B为质量百分比的89.9%
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99.9%乙腈、0.1%三氟乙酸和0%
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10%水，梯度洗脱；检测波长为210
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220 nm；流速为0.3
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0.4mL/min；进样体积为1μl；柱温为35
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40℃。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，色谱柱采用规格为2.1*100mm，填料粒径1.8μm，300
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的色谱柱。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，梯度洗脱的条件为：以流动相A95%，流动相B5%开始进行洗脱逐渐减小流动相A的比例，增加流动相B的比例，6
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6.5min后，达到流动相A35%，流动相B65%，继续洗脱0.3
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0.35min后，达到流动相A为5%，流动相B为95%；持续洗脱0.8
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0.83min后，流动相调整至流动相A为95%，流动相B调整至5%继续洗脱。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，梯度洗脱的条件为：以流动相A95%，流动相B5%开始进行洗脱逐渐减小流动相A的比例，增加流动相B的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海涛，王新波，李义龙，刘文革，刘惠清，李向群，
申请(专利权)人：湖南中晟全肽生化有限公司，
类型：发明
国别省市：