血管发生成纤维细胞制造技术

提供了用于重编程真皮成纤维细胞以表现出血管发生特性(包括在体内刺激血管发生的能力)的组合物和方法。根据一种实施方式，此类组合物与用于(包括糖尿病患者中)慢性伤口的标准治疗联合使用。准治疗联合使用。准治疗联合使用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血管发生成纤维细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求以下优先权：于2019年9月20日提交的美国临时专利申请号62/903,130和于2019年9月26日提交的美国临时专利申请号62/906,140，其公开内容明确并入本文。
[0003]美国政府支持声明
[0004]本专利技术在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的GM108014的政府支持下完成。政府对本专利技术享有一定的权利。
[0005]通过援引以电子方式提交的材料并入
[0006]通过援引以其全文并入本文的是同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并且其标识如下：1千字节ACII(文本)文件，命名为“322025_ST25.txt”，创建于2020年9月18日。

技术介绍

[0007]成纤维细胞是动物中最常见的结缔组织细胞。与衬在身体结构上的上皮细胞不同，成纤维细胞不形成平坦的单层，并且不受一侧基底层的附着极化的限制。成纤维细胞的主要功能是通过连续分泌细胞外基质的前体来维持结缔组织的结构完整性。成纤维细胞分泌细胞外基质的所有组分的前体，主要是基质和各种纤维。
[0008]最近已描述人和鼠组织具有显著的成纤维细胞异质性。这结合进一步理解成纤维细胞行为状态变化对于理解组织发育和体内平衡是如何必要的，为组织再生以及解决与不适当或非期望成纤维细胞活性相关的疾病状态提供了新策略。
[0009]对在发育期间或对损伤产生反应的不同成纤维细胞亚群中表现出特定行为状态变化的描述才刚出现。如本文所公开的，申请人已将单细胞RNA测序与详细的谱系特异性成纤维细胞功能和分子分析相结合，以鉴定在急性损伤后生理表观遗传调控的新型成纤维细胞亚群状态变化。

技术实现思路

[0010]根据本公开的一种实施方式，提供了用于将人真皮成纤维细胞重编程成为血管发生性的组合物和方法，其中，重编程的真皮成纤维细胞具有诱导血管形成的能力。该方法可以在体内或体外对真皮成纤维细胞进行。在一种实施方式中，所述方法包括降低成纤维细胞内miR
‑
200b丰度以产生保持成纤维细胞特征(包括例如存在成纤维细胞特异性蛋白
‑
1(Fsp
‑
1))的细胞，该细胞同时表现出血管发生特性，包括例如在培养物中和/或体内形成管腔毛细血管样结构。在一种实施方式中，将抗miR
‑
200b寡核苷酸(例如干扰RNA)转染到表达成纤维细胞特异性蛋白
‑
1(Fsp
‑
1)的人真皮成纤维细胞(HADF)中以修饰HADF，从而产生表现出血管发生特性的血管发生成纤维细胞。在一种实施方式中，血管发生特性包括以下特性中的一种或多种：
[0011]内皮细胞(EC)样形态学形状变化；
[0012]细胞表面血管内皮生长因子受体
‑
2(VEGFR2)表达上调；
[0013]血小板内皮细胞黏附分子1(PECAM
‑
1)的表达上调，也称为分化簇31(CD31)；
[0014]内皮一氧化氮合酶(eNOS)上调；
[0015]钙黏着蛋白5(CDH5)上调，以及
[0016]增强乙酰化低密度脂蛋白(Ac
‑
LDL)的摄取。此外，本文公开的血管发生成纤维细胞表现出在Matrigel上铺板时形成管状结构，和/或在3维(D)1型胶原凝胶中形成管腔结构，和/或在与脐带血内皮集落形成细胞的3D凝胶共培养物中形成嵌合管腔毛细管样结构的能力。在一种实施方式中，提供了血管发生成纤维细胞，其中，如图2B所示，相对于未如本申请中所述经重编程的天然真皮成纤维细胞，该血管发生成纤维细胞的一种或多种蛋白被上调或下调。
[0017]在一种实施方式中，提供了血管发生成纤维细胞，其中，该细胞表达成纤维细胞特异性蛋白
‑
1(Fsp
‑
1)和血管内皮生长因子受体
‑
2(VEGFR2)。任选地，细胞可以表达内皮细胞的另外标志物，其选自由以下组成的组：血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)、内皮一氧化氮合酶(eNOS)和钙黏着蛋白5(CDH5)。可以诱导本文公开的血管发生成纤维细胞以助于刺激患者中期望部位的血管形成。
附图说明
[0018]图1A和1B：通过抗miR
‑
200b寡核苷酸将真皮成纤维细胞直接重编程成血管发生状态。使用靶向miR
‑
200b的锁核酸(LNA)：具有硫代磷酸酯修饰的5'
‑
catcattaccaggcatatt
‑
3'(SEQ ID NO:1)。使用定制引物通过RT
‑
qPCR验证成功递送该19聚体ASO。使用与NCBI和miRBase数据库中任何生物体中的任何序列不具有>70％同源性匹配的类似19聚体寡核苷酸作为假性对照。观察转染对照或miR
‑
200b抑制剂的人成人真皮成纤维细胞(HADF)细胞的FSP
‑
1/CD
‑
31共定位的免疫细胞化学。用DAPI对细胞进行复染。(n＝3；结果未示出)；图1A在第7天时对照或miR
‑
200b抑制剂转染的HADF细胞中FSP1和CD31的定量。在miR
‑
200b抑制后d7时观察到三阳性FSP1+VEGFR2+CDH5+成纤维细胞的图1B图像，并提供了计算的APC强度图。
[0019]图2A和2B：单细胞RNA
‑
seq分析识别新成纤维细胞亚群状态变化。使用10
×
Genomics平台分析显示12880FSP+VEGFR2
‑
成纤维细胞和11333FSP+VEGFR2+成纤维细胞的单细胞转录组的均匀流形近似和投影(Uniform Manifold Approximation and Projection，UMAP)图。无监督聚类识别13个聚类。图2A提供了示出成纤维细胞(FSP+VEGFR2
‑
)和血管发生成纤维细胞(FSP+VEGFR2+)的每个聚类中的细胞数量的柱状图。单细胞分析显示，在miR
‑
200b抑制后，血管发生成纤维细胞的某些聚类获得血管生成特征。在FSP+VEGFR2+成纤维细胞中检测到高水平的促血管生成标志物CITED2、GLUL、RRAS和PDGFRB以及低水平的抗血管生成标志物SERPINE1、PGK1、PDCD10和ITGB1BP1。在miR
‑
200b抑制后每天增加的其他特征基因是：VEGFB、VEGFC、NRP1、NRP2、FLT1、VEGFR1、VEGFR2、MAP2K1、MAP2K2、RAF1、KRAS、NOS3和PTEN。血管发生成纤维细胞的分子特征在图2B中提供。
[0020]图3A和3B：通过miR
‑
200b抑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于重编程人真皮成纤维细胞以相对于原始成纤维细胞表现出一种或多种血管发生特性的方法，其中，重编程的细胞表现出至少以下特性：内皮细胞(EC)样形态学形状变化；细胞表面血管内皮生长因子受体
‑
2(VEGFR2)表达上调；血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)的表达上调；内皮一氧化氮合酶(eNOS)上调；钙黏着蛋白5(CDH5)上调，以及乙酰化低密度脂蛋白(Ac
‑
LDL)的摄取增强；在表达成纤维细胞特异性蛋白
‑
1(Fsp
‑
1)的同时，所述方法包括降低所述细胞中功能性miR
‑
200b的浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过用干扰RNA转染细胞来降低miR
‑
200b浓度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将抗miR
‑
200b寡核苷酸递送至人真皮成纤维细胞的胞质溶胶中。4.根据权利要求3所述的方法，其中，将所述抗miR
‑
200b寡核苷酸在体内递送至人真皮成纤维细胞的胞质溶胶中。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中，细胞内递送是经由组织纳米转染。6.由权利要求1
‑
5中任一项所述的方法产生的血管发生成纤维细胞，其中，所述血管发生成纤维细胞表达成纤维细胞特异性蛋白
‑
1(Fsp
‑
1)，以及选自由以下组成的组的至少一种蛋白：血管内皮生长因子受体
‑
2(VEGFR2)表达、血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)、内皮...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱丹，
申请(专利权)人：印地安纳大学理事会，
类型：发明
国别省市：