用于体内双重组酶介导的盒式交换(dRMCE)的系统和方法及其疾病模型技术方案

本文描述了用于双重组酶介导的盒式交换的供体载体和系统。本文还描述了用于对转基因表达进行一致、严格和易做到的研究的动物模型和人类细胞。本文进一步描述了使用这些动物模型筛选治疗药物的方法和治疗方法。型筛选治疗药物的方法和治疗方法。型筛选治疗药物的方法和治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体内双重组酶介导的盒式交换(dRMCE)的系统和方法及其疾病模型
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]根据35 U.S.C.
§
119(e)，本申请包括要求2019年6月17日提交的美国临时专利申请号62/862,576的优先权，以引用的方式将其整体并入在此。
[0003]关于联邦政府资助的研究或开发的声明
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的CA202900和CA236687的政府支持下完成的。美国政府拥有本专利技术的某些权利。

技术介绍

[0005]基因工程化小鼠模型(GEMM)是在体内以时间特异性和组织特异性方式分析基因功能的典范。然而，由于GEMM的生成是昂贵的费力的过程，许多替代性的转基因方法(例如电穿孔(EP)介导的基因递送和病毒基因递送)已被越来越多地作为创建体细胞镶嵌体的更快速和有效的方法。这两种方法都需要向特定组织注射病毒或外来DNA，以转导周围的细胞并创建体细胞镶嵌体。EP可以使用转座子或者效率较低地用CRISPR/Cas9和随后插入供体模板来产生基因组插入的DNA。尽管它们速度快，但这些方法有大的缺陷，这阻碍了更广泛的应用。病毒载体具有有限的有效载荷、引起免疫应答、并且需要专门的专业知识，而转座子和病毒方法两者都受制于它们不可预料的基因组整合模式、可能的插入突变和表观遗传的转基因沉默。两者都受制于转基因拷贝数的可变性和过表达假象(artifacts)(例如细胞毒性和转录压制)，因此克隆基因型/表型的可变性是显著的混淆因素。
[0006]随着数以百计的复发性、推定的癌症驱动基因突变的鉴别(其中许多为功能获得型(GOF)癌基因，有必要创建易于处理的体内平台，该平台可模拟这些潜在的癌基因，可能与肿瘤抑制因子突变相结合。对于每个GOF癌基因来说，往往有数十个不同的复发性错义突变，可以按不同的方式发挥作用。许多公知的肿瘤抑制因子突变体为功能丧失型(LOF)表型，对此我们可以利用大规模的KO小鼠联合会来繁育多KO小鼠(例如，Pten/p53/Nf1
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KO)。即使如此，创建此类小鼠也显著耗时、昂贵并且易于有一些方法学混淆。另外，CRISPR/Cas9系统可以同时在小鼠体内诱导多个KO，但可具有显著的非预期的脱靶基因组改变。

技术实现思路

[0007]在一个方面，本文提供了灵活的体内平台，所述平台可同时模拟GOF和LOF突变的组合，不仅低廉而且以GEMM样的方式进行。我们证明成功的双重组酶介导的盒式交换(dRMCE，或MADR)可以在具有重组细胞的明确的遗传标记的良好表征的报告小鼠中的体细胞中原位催化。此外，我们证明了该系统在产生与GOF和LOF突变(包括患者特异性的驱动基因突变)的混合物的镶嵌现象方面的效用。最终，我们的MADR肿瘤模型表明，这种方法有潜力成为用于测试和研究各种推定的肿瘤驱动基因突变的更高通量的第一道(first
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pass)实验，并以患者特异性的方式为临床前药物发现提供快速的管线。
[0008]本文描述了对建立用于细胞疗法的转基因细胞而言有用的系统、核酸和载体。这
些载体规避了与目前用于创建具有稳定整合在基因组位置中的转基因的细胞的方法有关的问题。目前的问题包括缺乏对倍性(ploidy)的控制，缺乏对整合位点的控制，以及对转基因插入大小的限制。本文描述的系统解决了这些问题，并允许更安全、更可重复的细胞疗法的方法。这些系统和使用它们的方法可适用于建立用于向患有神经退行性疾病(例如帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)或阿尔茨海默氏病)的受试者递送基因产物(如神经营养因子和/或生长因子)的细胞和细胞系。
[0009]在一个方面，本文描述了包含基因组整合的转基因的哺乳动物细胞，其中，基因组整合的转基因包括神经营养因子，并被整合在基因组位点处，所述基因组位点包括AAVS1基因座、H11基因座或HPRT1基因座。在某些实施方式中，该细胞为人类细胞。在某些实施方式中，该人类细胞为诱导多能干细胞。在某些实施方式中，神经营养因子包括胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、neurturin、生长/分化因子(GDF)5、中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)、大脑多巴胺能神经营养因子(CDNF)，或它们的组合。在某些实施方式中，神经营养因子为GDNF。在某些实施方式中，神经营养因子处于诱导型启动子的控制下。在某些实施方式中，诱导型启动子是四环素或多西环素诱导型启动子。在某些实施方式中，神经营养因子和/或诱导型启动子侧接有重组酶识别位点、可转座元件的串联重复区或绝缘子序列中的一个或多个。在某些实施方式中，将转基因的单个拷贝整合至细胞的基因组中。在多种实施方式中，神经营养因子和/或诱导型启动子侧接有成对的重组酶识别位点。在多种实施方式中，所述成对的重组酶识别位点包括变体重组酶识别位点和野生型重组酶识别位点。在多种实施方式中，与野生型重组酶识别位点相比，变体重组酶识别位点表现出降低的重组酶的切割。在多种实施方式中，所述成对的重组酶识别位点包括LoxP位点或FRT位点。
[0010]在另一个方面，本文描述了如下的系统，所述系统包含：(a)无启动子的供体载体，所述供体载体包含在转基因或编码RNA的核酸上游的多聚腺苷酸化信号或转录终止元件、所述转基因或编码RNA的核酸和成对的重组酶识别位点；以及(b)一个表达载体，所述表达载体包含编码重组酶的两个基因，所述重组酶对成对的重组酶识别位点具有特异性；或者两个表达载体，第一表达载体包含编码第一重组酶的一个基因，所述第一重组酶对所述成对的重组酶识别位点中的一个具有特异性，并且第二表达载体包含编码第二重组酶的一个基因，所述第二重组酶对所述成对的重组酶识别位点中的另一个具有特异性。在某些实施方式中，无启动子的供体载体选自于由质粒、病毒载体和细菌人工染色体(BAC)所组成的组。在某些实施方式中，无启动子的供体载体包含在所述转基因或编码所述RNA的核酸上游的至少四个多聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，无启动子的供体载体进一步包含转录后调控元件。在某些实施方式中，无启动子的供体载体进一步包含在转基因或编码所述RNA的核酸下游的多聚腺苷酸化信号。在某些实施方式中，无启动子供体载体包含：PGK多聚腺苷酸化信号(pA)；三聚化SV40pA；转基因或编码RNA的核酸；loxP和翻转酶识别靶标(FRT)；兔β
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珠蛋白pA；以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在某些实施方式中，成对的重组酶识别位点为loxP和翻转酶识别靶标(FRT)，并且重组酶为cre和flp。在某些实施方式中，成对的重组酶识别位点为VloxP和翻转酶识别靶标(FRT)，并且重组酶为VCre和flp。在某些实施方式中，成对的重组酶识别位点是为SloxP和翻转酶识别靶标(FRT)，并且重组酶为SCre和flp。在某些实施方式中，重组酶为PhiC31重组酶，并且重组酶识别位点为attB和attP。在某些实施方式中，其中重组酶为Nigri、Panto或Vika，并且重组酶识别位点分别是
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种系统，所述系统包括：无启动子的供体载体，所述无启动子的供体载体包含在转基因或编码RNA的核酸上游的多聚腺苷酸化信号或转录终止元件、所述转基因或编码RNA的核酸和成对的重组酶识别位点；以及一个表达载体，所述表达载体包含编码重组酶的两个基因，所述重组酶对所述成对的重组酶识别位点具有特异性，或两个表达载体，第一表达载体包含编码第一重组酶的一个基因，所述第一重组酶对所述成对的重组酶识别位点中的一个具有特异性，并且第二表达载体包含编码第二重组酶的一个基因，所述第二重组酶对所述成对的重组酶识别位点中的另一个具有特异性。2.如权利要求1所述的系统，其中，所述无启动子的供体载体选自于由质粒、病毒载体和细菌人工染色体(BAC)所组成的组。3.如权利要求1所述的系统，其中，所述无启动子的供体载体包含在所述转基因或编码所述RNA的核酸上游的至少四个多聚腺苷酸化信号。4.如权利要求1所述的系统，其中，所述无启动子的供体载体进一步包含转录后调控元件。5.如权利要求1所述的系统，其中，所述无启动子的供体载体进一步包含在所述转基因或编码所述RNA的核酸下游的多聚腺苷酸化信号。6.如权利要求1所述的系统，其中，所述无启动子的供体载体进一步包含以剪接受体开始的开放阅读框(ORF)。7.如权利要求1所述的系统，其中，所述无启动子的供体载体进一步包含荧光报告子。8.如权利要求1所述的系统，其中，所述病毒载体为腺相关病毒(AAV)载体。9.如权利要求1所述的系统，其中，包含重组酶的所述表达载体处于组织特异性启动子下。10.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述成对的重组酶识别位点为loxP和翻转酶识别靶标(FRT)，并且所述重组酶为cre和flp。11.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述成对的重组酶识别位点为经修饰的loxP和/或经修饰的翻转酶识别靶标(FRT)，并且所述重组酶为cre和flp。12.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述成对的重组酶识别位点为VloxP和翻转酶识别靶标(FRT)，并且所述重组酶为VCre和flp。13.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述成对的重组酶识别位点为SloxP和翻转酶识别靶标(FRT)，并且所述重组酶为SCre和flp。14.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述重组酶为PhiC31重组酶，并且所述重组酶识别位点为attB和attP。15.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述重组酶为Nigri、Panto或Vika，并且重组酶识别位点分别为nox、pox和vox。16.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述成对的重组酶识别位点中的一个或两个包含突变。17.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述RNA为siRNA、shRNA、sgRNA、lncRNA或miRNA。
18.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述转基因或所述RNA包含疾病相关的突变。19.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述转基因或所述RNA包含功能获得型(GOF)基因突变、功能丧失型(LOF)基因突变、或两者。20.如权利要求1
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9中任一项所述的系统，其中，所述转基因包括如下因子，所述因子防止神经元细胞凋亡或促进神经元细胞存活、增加神经元细胞的增殖、或促进神经元细胞的分化。21.如权利要求20所述的系统，其中，所述因子为生长因子。22.如权利要求21所述的系统，其中，所述生长因子包括胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、neurturin、生长/分化因子(GDF)5、中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)、大脑多巴胺能神经营养因子(CDNF)或它们的组合。23.如权利要求21所述的系统，其中，所述生长因子包括胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)。24.如权利要求1所述的系统，其中，所述无启动子的供体载体包含：PGK多聚腺苷酸化信号(pA)；三聚化的SV40pA；所述转基因或编码RNA的核酸；loxP和翻转酶识别靶标(FRT)；兔β
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珠蛋白pA；以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。25.一种无启动子的供体载体，所述无启动子的供体载体包含：在转基因或编码RNA的核酸上游的多聚腺苷酸化信号或转录终止元件；所述转基因或编码RNA的核酸；以及成对的重组酶识别位点。26.如权利要求25所述的无启动子的供体载体，其中，所述无启动子的供体载体选自于由质粒、病毒载体和细菌人工染色体(BAC)所组成的组。27.如权利要求25所述的无启动子的供体载体，所述无启动子的供体载体包含在所述转基因或编码所述RNA的核酸上游的至少四个多聚腺苷酸化信号。28.如权利要求25所述的无启动子的供体载体，所述无启动子的供体载体进一步包含转录后调控元件。29.如权利要求25所述的无启动子的供体载体，所述无启动子的供体载体进一步包含在所述转基因或编码所述RNA的核酸下游的多聚腺苷酸化信号。30.如权利要求25所述的无启动子供体载体，其中，所述转基因或RNA选自于由以下所组成的组：癌基因、肿瘤抑制基因的功能丧失型(LOF)突变、原癌基因的功能获得型(GOF)突变、假基因、siRNA、shRNA、sgRNA、lncRNA、miRNA、表观遗传修饰、与人类疾病相关的非编码基因异常或表观遗传异常、以及它们的组合。31.如权利要求25所述的无启动子的供体载体，其中，所述转基因包括如下因子，所述因子防止神经元细胞凋亡或促进神经元细胞存活、增加神经元细胞的增殖或促进神经元细胞的分化。
32.如权利要求31所述的无启动子的供体载体，其中，所述因子为生长因子。33.如权利要求32所述的无启动子的供体载体，其中，所述生长因子包括胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)、neurturin、生长/分化因子(GDF)5、中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(MANF)或大脑多巴胺能神经营养因子(CDNF)、或它们的组合。34.如权利要求32所...

【专利技术属性】
技术研发人员：约书亚，
申请(专利权)人：西达赛奈医疗中心，
类型：发明
国别省市：