一种调控花朵衰老的RhBEE3基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术领域，公开了一种调控花朵衰老的RhBEE3基因及应用；RhBEE3基因为月季(Rosa hybrida

【技术实现步骤摘要】
一种调控花朵衰老的RhBEE3基因及其应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种从切花月季中分离、克隆的一个基本螺旋
‑
环
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螺旋(bHLH)类转录因子RhBEE3，以及RhBEE3基因在调控花朵衰老中的应用。

技术介绍

[0002]花朵的开放和衰老是被子植物生长发育中的一个重要阶段。花朵依靠其独特的外观、色彩和香味吸引动物协助授粉，授粉完成后，花朵逐渐走向衰老，具体表现为花朵的萎蔫、脱落和花色的变化。花朵衰老是一个高度程序化的事件，包含了一系列生理生化过程，如细胞内结构的解体、大分子和膜系统的降解以及物质的循环利用等(Price et al.,2008；Xu et al.,2000)。据报道，植物激素作为一个关键因素在花的衰老过程中起重要作用，其中乙烯被广泛认为是发育的中心调节因子，参与调控花朵衰老的生理过程。
[0003]乙烯已被证明能促进许多观赏植物的开花，如剑兰(Gladiolus gandavensis)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、月季(R.hybrida)、腊梅(Chimonanthus praecox)等。如梅花花朵经外源乙烯处理可迅速达到盛开阶段，而乙烯抑制剂1
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甲基环丙烯(1
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MCP)处理可显著延迟花朵开放(Suietal.,2015)。乙烯生物合成基因的转录上调被认为是乙烯促进花朵衰老的主要原因。例如，通过外源应用乙烯的生物合成前体ACC可以加速扶桑(Hibiscus rosa
‑
sinensisL.)花朵的衰老(Trivellini etal.,2011)。在石竹(D.chinensis)花衰老过程中，乙烯合成基因ACS和ACO的表达也显著增加(Tanase et al.,2015)。而除此之外，转录因子参与的乙烯响应也是影响花衰老的重要因素。
[0004]转录因子(TFs)通过以序列特异性的方式直接与靶基因的启动子结合来控制多种生理过程。TFs功能丰富，参与多种植物激素的信号响应，并被报道广泛参与了植物激素介导的花朵衰老，例如，在拟南芥中，过表达FOREVER YOUNG FLOWER(FYF)通过下调ETHYLENE RESPONSE DNA
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BINDING FACTOR 1/2(EDF1/2)从而抑制乙烯反应来延缓花的衰老(Chen e tal.,2011)。这种抑制作用被证明是由ERF基因FUF1介导的(Chen et al.,2015)。近年来有报道称，乙烯诱导矮牵牛花花冠中PhERF6的表达逐渐增加。PhERF6蛋白与EOBI(EMISSION OF BENZENOIDSI)发生互作，从而阻止EOBI激活ODO1(ODORANT1)基因，导致挥发性物质的产生减少(Liu et al.,2017)。这表明乙烯响应的转录因子基因可能参与了乙烯诱导的衰老和次生代谢的调节。
[0005]基本螺旋
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环
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螺旋(bHLHs)转录因子广泛分布于所有真核生物中，构成了最大的转录因子家族之一(Ledent et al.,2001；Riechmann et al.,2000)。bHLHs参与控制许多生物过程的转录调控，如损伤和干旱胁迫(Kiribuchi et al.,2004)、光信号传递(Leivar et al.,2008；Roig
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Villanova et al.,2007)、根和气孔发育(Menand et al.,2007；Pillitteri et al.,2007)以及果实发育(Liljegren et al.,2004)等。有研究表明，bHLH转录因子通过参与激素信号传导途径调控植物生长发育。例如，bHLH转录因子广泛参与到JA的信号传导途径(Jonas et al.,2017；Wanget al.,2014)。在JA信号中，bHLH转录因子还
与MYB转录因子相互作用，形成转录复合物调控花朵发育(Qi et al.,2015)。在BR信号中，一对BZR1下游的HLH/bHLH转录因子通过拮抗BR调控植物发育(Zhang et al.,2009)。此外，还发现了一个矮牵牛中的bHLH转录因子PhFBH4与ACS1的启动子结合，从而影响到乙烯的合成并调控花朵的衰老(Yin et al.,2015)。这些研究均表明bHLH转录因子的一些成员可能通过参与激素信号传导途径调控花朵衰老的过程。目前在月季中还没有bHLH转录因子调控花朵衰老的研究报道。在月季分子育种方面，前人通过将三色堇(Viola spp.)中的类黄酮3
’
,5
’‑
羟化酶(flavonoid 3
’
,5
’‑
hydoxylase,F3
’5’
H)基因转入月季，培育出转基因蓝色月季品种(Katsumoto etal.,2007)。未来有望利用基因工程在月季中进行RhBEE3基因的干涉或敲除，这将在延缓月季花朵衰老，延长花期方面有很大的潜力。

技术实现思路

[0006]为解决以上技术问题，本专利技术提供了一种花朵基因RhBEE3，所述基因RhBEE3为月季(Rosa hybrida
‘
Samantha
’
)基本螺旋
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环
‑
螺旋(bHLH)类转录因子，其序列如SEQ ID NO.1所示，所述花朵基因RhBEE3编码的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述花朵基因RhBEE3的3
’
端非翻译区(3
’‑
UTR)序列为SEQ ID NO.3所示。
[0007]为解决以上技术问题，本专利技术还提供了一种花朵基因RhBEE3在调控花朵衰老中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
[0008](1)RhBEE3基因的克隆；
[0009](2)RhBEE3在花朵开放不同时期的表达模式与乙烯诱导表达分析；
[0010](3)沉默载体构建以及在月季花瓣中的瞬时沉默；
[0011](4)过表达载体构建以及在月季花瓣中的瞬时过表达；
[0012](5)过表达载体转化烟草及转基因烟草表型和花冠衰老检测。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术利用转基因技术为延缓花朵衰老提供重要的基因工程方法，突破了传统育种手段的障碍；此外本专利技术的基因在烟草中性状稳定，为花朵衰老分子机制研究提供理论依据。
附图说明
[0014]图1为本专利技术的技术流程图；
[0015]图2为本专利技术的RhBEE3基因的系统进化分析图；
[0016]图3为本专利技术的RhBEE3在月季开放不同阶段的表达分析；
[0017]图4为本专利技术的RhBEE3在乙烯处理后月季花朵中的表达分析；
[0018]图5为本专利技术的RhBEE3沉默载体的构建图谱；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种花朵基因RhBEE3，其特征在于，所述花朵基因RhBEE3为月季(Rosa hybrida
‘
Samantha
’
)基本螺旋
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环
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螺旋(bHLH)类转录因子，其序列如SEQ ID NO.1所示，所述花朵基因RhBEE3编码的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述花朵基因RhBEE3的3
’
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗靖，陈訾强，李蕊蕊，陈思嘉，张通，唐祺，王彩云，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：