一种花生抗青枯病NBS-LRR编码基因AhRRS1及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种一种花生抗青枯病NBS

【技术实现步骤摘要】
一种花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1及其应用。

技术介绍

[0002]由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的土传性青枯病是世界范围内最为广泛的细菌性病害之一，被称为植物的“癌症”，能侵染54个科的450多种植物。作为一种维管束病害，花生青枯病危害十分严重，会造成花生减产甚至绝收，严重威胁花生产量和品质。通过常规的化学药剂和生物防治并不能有效的防治该病的发生，通过合理轮作、间作和套作也不能真正有效的解决病害的流行和传播，最有效的手段还是培育抗病品种，但是传统杂交育种方法选育出的抗病品种存在抗性与高产优质负相关的问题，抗病候选基因的定位、克隆以及利用基因工程将抗病相关基因转化花生获得高产优质抗青枯病花生品种是有效解决花生受青枯病侵染的有效途径。
[0003]植物中克隆的抗病基因大多数是NBS
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LRR类抗病基因，NBS
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LRR基因广泛的存在于植物中且在抵御病原菌侵染过程中有极其重要的作用。根据NBS
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LRR氨基酸结构域的特点，主要将NBS
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LRR分为三大类：TIR
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NBS
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LRR、CC
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NBS
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LRR和Rpw8
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NBS
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LRR(RNL)。普遍认为，过量表达某些NBS
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LRR基因中编码CC或TIR结构域的基因能触发植物的超敏反应。目前，对于NBS
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LRR家族基因的研究已经在拟南芥、水稻、马铃薯和小麦等作物中开展。花生中通过正向遗传学QTL定位克隆的抗青枯病的NBS
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LRR类基因还未见报道。
[0004]本专利技术针对以上研究背景，在本课题组前期通过筛选获得高抗花生青枯病抗源，可抗各地青枯病，在此基础上与高感地方品种杂交，构建了一个含1200多个系的高代稳定RIL大群体，通过花生抗青枯病QTL定位和GWAS分析的基础上，获得与抗性紧密连锁的SNP分子标记，该标记能引起NBS
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LRR类抗病基因AhRRS1在抗、感品种中非同义突变引起的氨基酸变化，开发对应的SNP标记并在关联抗源验证和极端抗、感RIL后代中验证。通过RT
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PCR克隆获得该基因的CDS序列，通过构建超表达载体由农杆菌介导异源转化烟草表现对青枯病的抗性。这将为花生抗青枯病分子标记辅助育种提供标记资源，为植物抗青枯病育种提供基因源，并为抗青枯病分子机理解析提供基础。

技术实现思路

[0005]本专利技术，针对上述问题提供一种一种花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1及其应用。本专利技术的NBS
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LRR编码基因AhRRS1主要通过QTL定位获得关键候选基因，在该基因抗、感品种的序列差异中开发具有多态性的SNP分子标记，在抗、感品种中能引起氨基酸序列变异，并通过琼脂糖凝胶电泳分析验证等位基因SNP标记在抗病关联群体和抗、感杂交群体高抗和高感极端材料中的多态性。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1，其CDS序列长度为1470 bp，具体核苷
酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]一种上述花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为489aa，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
[0008]一种含有上述花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1的表达载体。
[0009]上述花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1在植物抗青枯病基因工程中的应用；所述植物包括但不限于烟草、花生。
[0010]上述花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1编码的蛋白在植物抗青枯病中的应用。
[0011]上述含有花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1的表达载体在植物抗青枯病基因工程中的应用。
[0012]本专利技术的有益效果：本专利技术是通过基于花生抗青枯病QTL定位和GWAS分析基础上，克隆和序列比较开发获得的具有多态性的SNP分子标记，通过抗感亲本等位基因序列差异的多态性标记在抗、感杂交群体高抗和高感极端材料和关联抗源中进行验证。经过PCR克隆获得编码该蛋白的ORF序列，通过一步连接法构建CaMV 35S启动子驱动AhRRS1基因植物表达载体pBI121
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AhRRS1，将其转化GV3101农杆菌，通过叶盘法将其导入红花大金元烟草上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种，结果证明该转基因烟草对青枯菌的侵染的抗性增强。表明该基因在花生抗青枯病分子标记辅助育种中可以提供检测抗性紧密连锁的分子标记，这为花生抗青枯病的分子机理提供理论基础，为植物抗青枯病基因工程的提供基因资源，在植物抗青枯病基因工程中具有十分广阔的应用价值。
附图说明
[0013]图1为AhRRS1分子标记在抗、感亲本和极端抗、感材料以及在抗青枯病抗源中的验证；a:用qRBW12_F和qRBW12r_R引物扩增；b:qRBW12_F和qRBW12s_R引物扩增;S: 感青枯病花生亲本新会小粒； R：抗青枯病花生品种粤油92。
[0014]图2为超表达花生AhRRS1引起本氏烟草过敏性反应分析。
[0015]图3为花生AhRRS1基因在抗感品种接种青枯菌后的表达模式分析。
[0016]图4为花生AhRRS1超量表达（AhRRS1
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OE）转基因烟草中增强对青枯菌侵染的抗性。
具体实施方式
[0017]实施例1 基于QTL和GWAS测序筛选获得花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1基于通过抗青枯病花生品种粤油92（YY92）和感青枯病花生品种新会小粒（XHXL）杂交获得的1248个F13代RIL群体，对亲本和1248个RIL系进行重测序，开发多态性的SNP标记，根据RIL后代的多年多点的抗病鉴定数据，QTL和GWAS联合分析获得抗青枯病的基因组关联区域，最终定位到12号染色体4.0 M的基因组区域范围，其中标记qRBW12是位于12号染色体上编码NBS
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LRR的抗病基因AhRRS1基因上的在抗感亲本上引起非同义突变的SNP标记。在花生基因组资源数据库（http://peanutgr.fafu.edu.cn/）进行比对和下载AhRRS1基因的CDS序列和氨基酸序列。根据AhRRS1基因下载序列设计克隆引物AhRRS1
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F：5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1，其特征在于：所述花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1的CDS序列长度为1470 bp，具体核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.一种如权利要求1所述花生抗青枯病NBS
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LRR编码基因AhRRS1编码的蛋白，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列为489aa，具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。3.一种含有权利要求1所述花生抗青枯病NBS
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【专利技术属性】
技术研发人员：庄伟建，陈华，王珊珊，刘欢，庄宇慧，魏桐，蔡铁城，杨强，付辉文，高眉佳，
申请(专利权)人：深圳华大万物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：