拉沙病毒疫苗制造技术

本发明专利技术涉及包含活的、感染性的、减毒的黄病毒序列的多核苷酸，其中编码沙粒病毒糖蛋白的至少一部分的核苷酸序列位于所述黄病毒的E基因和NS1基因之间的基因间区域，使得表达嵌合病毒，其特征在于所述黄病毒E蛋白的C末端和所述黄病毒NS1蛋白的信号肽的N末端的编码序列按以下顺序包含：

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】拉沙病毒疫苗


[0001]本专利技术涉及基于嵌合黄病毒的疫苗。本专利技术还涉及针对病毒例如拉沙病毒的疫苗。

技术介绍

[0002]目前，没有获得批准的针对拉沙病毒(LASV)的许可人类疫苗。已经产生了许多不同的候选疫苗，涉及多种平台技术。最先进的候选物是基于VSV的LASV(VSV
‑
LASV
‑
GPC)、Mopeia病毒(MOPV)/LASV重配病毒(克隆ML29)和称为INO
‑
4500(pLASV
‑
GPC)的DNA疫苗。基于VSV的LASV候选疫苗包含具有复制能力的VSV，其表达LASV的糖蛋白。ML29是拉沙病毒和Mopeia病毒之间的重配株，携带MOPV的L区段和LASV的S区段(核蛋白和糖蛋白)。INO
‑
4500是一种编码来自Josiah f株的LASV
‑
GPC基因的DNA疫苗，它来自Inovio公司(pLASV
‑
GPC)。
[0003]除了使用上述不同的方法外，黄热病病毒17D也已被用作拉沙病毒糖蛋白(GPC)或其亚基GP1和GP2的载体(Bredenbeek等人(2006)Virology 345,299
‑
304和Jiang等人(2011)Vaccine 29,1248
‑
1257))。在这些构建体中，GP基因(缺乏信号肽，SSP)(或GP1或GP2序列)被插入YF
‑
E/NS1之间。这些构建体在C末端具有源自YF
‑
E、WNV
‑
E或人工设计序列的插入融合序列。这些构建体需要转染在细胞中，从中衍生的病毒被用作疫苗。
[0004]唯一刚刚开始I期临床试验的疫苗是INO
‑
4500(pLASV
‑
GPC)。这种疫苗需要通过皮肤电穿孔提供多个高剂量，以实现全面保护并增强疫苗免疫反应。这种多剂量施用方案在LASV地方性流行并且已发生主要暴发的西非农村地区的实施将非常具有挑战性。
[0005]关于其他候选物，ML29被EU归为风险组2，以及被US CDC归为风险组3，这是进一步开发该疫苗的障碍。VSV
‑
LASV
‑
GPC仍然需要冷链来保存它，这涉及到高成本，并且仍然没有关于其安全性的研究。涉及YF17D作为表达拉沙糖蛋白前体的载体的方法在NHP研究中并不成功(0％存活率，狨猴)。
[0006]此外，该候选疫苗显示出遗传不稳定性问题，无法按照疫苗生产的要求扩大技术规模。

技术实现思路

[0007]我们使用我们的PLLAV(质粒启动减毒活疫苗)技术和黄热病减毒活疫苗株(YFV
‑
17D)作为载体，通过将LASV
‑
GPC(在切割位点R246A中具有突变以保持GP1和GP2结合，以及额外的突变R207C、G360C和E329P)插入黄热病E/NS1基因间区域来设计转基因疫苗，如下所示：删除N末端(Nt)信号肽，将NS1的前9个氨基酸(27个核苷酸)添加到LASV
‑
GPC的Nt，以允许正确释放LASV
‑
GPC蛋白，删除跨膜结构域，将胞外结构域与WNV跨膜结构域1和2融合。由此产生的PLLAV
‑
YFV17D
‑
LASV
‑
GPC启动了表达功能性LASV
‑
GPC和YFV
‑
17D蛋白的可行减毒活病毒。PLLAV
‑
YFV17D
‑
LASV
‑
GPC构建体可以直接用作疫苗，这涉及该疫苗是热稳定的。该疫苗在单次注射后诱导针对LASV和YFV的免疫反应。已经生成了第二种类似的构建体，其中切割位点已恢复(R246A突变恢复为R246R)。(附加数据中的附加信息)
[0008]PLLAV
‑
YFV17D
‑
LASV
‑
GPC是一种诱导YFV和拉沙病毒特异性免疫的双重疫苗。PLLAV
‑
YFV17D
‑
LASV
‑
GPC也可用作生产组织培养衍生的减毒活疫苗的稳定种子，不仅在PLLAV模式中，而且出乎意料的是，重组YFV17D
‑
LASV
‑
GPC病毒似乎在基因上超过Bredenbeek等人和Jiang等人(上文引用)在现有技术中公开的。
[0009]本专利技术进一步概括为以下陈述：
[0010]1.多核苷酸，其包含活的、感染性的、减毒的黄病毒的序列，其中编码沙粒病毒糖蛋白的至少一部分的核苷酸序列位于所述黄病毒的E基因和NS1基因之间的基因间区域，使得表达嵌合病毒，其特征在于所述黄病毒E蛋白的C末端和所述黄病毒NS1蛋白的信号肽的N末端的编码序列按以下顺序包含：
[0011]‑
黄病毒NS1蛋白的另一信号肽，
[0012]‑
缺乏N末端信号序列和GP2跨膜结构域的沙粒病毒糖蛋白，
[0013]‑
黄病毒E蛋白的TM1和TM2结构域。
[0014]2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述活的、感染性的、减毒的黄病毒的序列是黄热病病毒，通常是YF17D株。
[0015]3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述活的、感染性的、减毒的黄病毒主链是两种不同黄病毒的嵌合主链。
[0016]4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述沙粒病毒是Mammarena病毒。
[0017]5.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中所述沙粒病毒是拉沙病毒。
[0018]6.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述拉沙病毒株是Josiah株。
[0019]7.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述糖蛋白包含R207C、G360C和E329P稳定突变。
[0020]8.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述糖蛋白包含R246A蛋白水解切割位点。
[0021]9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸，其中G蛋白的核苷酸序列被密码子优化以改善在哺乳动物细胞中的表达。
[0022]10.根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸，其中所述NS1蛋白的信号肽包含序列DQGCAINFG[SEQ ID NO：10]或由其组成。
[0023]11.根据权利要求1至10中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄病毒E蛋白的TM1和TM2结构域来自西尼罗河病毒。
[0024]12.根据权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄病毒E蛋白的TM1结构域具有SEQ ID NO：14的序列。
[0025]13.根据权利要求1至12中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄病毒E蛋白的TM2结构域具有SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.多核苷酸，其包含活的、感染性的、减毒的黄病毒的序列，其中编码沙粒病毒糖蛋白的至少一部分的核苷酸序列位于所述黄病毒的E基因和NS1基因之间的基因间区域，使得表达嵌合病毒，其特征在于所述黄病毒E蛋白的C末端和所述黄病毒NS1蛋白的信号肽的N末端的编码序列按以下顺序包含：
‑
黄病毒NS1蛋白的另一信号肽，
‑
缺乏N末端信号序列和GP2跨膜结构域的沙粒病毒糖蛋白，
‑
黄病毒E蛋白的TM1和TM2结构域。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述活的、感染性的、减毒的黄病毒的序列是黄热病病毒，通常是YF17D株。3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述沙粒病毒是Mammarena病毒。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中所述沙粒病毒是拉沙病毒。5.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中编码的蛋白质序列包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述糖蛋白包含R207C、G360C和E329P稳定突变。7.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中所述糖蛋白包含R246A蛋白水解切割位点。8.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述NS1蛋白的信号肽包含序列DQGCAINFG[SEQ ID NO：10]或由其组成。9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄病毒E蛋白的TM1结构域具有SEQ ID NO：14的序列，或其中所述黄病毒E蛋白的TM2结构域具...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：勒芬天主教大学，
类型：发明
国别省市：